Name: establishing a liquid-covered culture of polarized human airway epithelial calu-3 cells to study host cell response to respiratory pathogens in vitro
Uploaded: 2013-02-07T13:00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro at JoVE.

Авторы хотели бы поблагодарить Элизабет Blanchard за техническую помощь. Результаты и выводы в настоящем докладе, принадлежат авторам и не обязательно отражают точку зрения Центра по контролю и профилактике заболеваний.

<ol>
	<li>Zhu, Y., Chidekel, A., Shaffer, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+human+airway+epithelial+cells+(calu-3):+a+model+of+human+respiratory+function,+structure,+and+inflammatory+responses.">Cultured human airway epithelial cells (calu-3): a model of human respiratory function, structure, and inflammatory responses.</a> Critical care research and practice. 2010, (2010).</li><li>Mukherjee, M., Pritchard, D. I., Bosquillon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+air-interfaced+Calu-3+cell+layers+for+investigation+of+inhaled+drug+interactions+with+organic+cation+transporters+in+vitro.">Evaluation of air-interfaced Calu-3 cell layers for investigation of inhaled drug interactions with organic cation transporters in vitro.</a> International journal of pharmaceutics. 426, 7-14 (2012).</li><li>Baginski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigations+into+the+fate+of+inhaled+salmon+calcitonin+at+the+respiratory+epithelial+barrier.">Investigations into the fate of inhaled salmon calcitonin at the respiratory epithelial barrier.</a> Pharmaceutical research. 29, 332-341 (2012).</li><li>Vllasaliu, D., Alexander, C., Garnett, M., Eaton, M., Stolnik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc-mediated+transport+of+nanoparticles+across+airway+epithelial+cell+layers.">Fc-mediated transport of nanoparticles across airway epithelial cell layers.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. , (2011).</li><li>Vinhas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pollen+proteases+compromise+the+airway+epithelial+barrier+through+degradation+of+transmembrane+adhesion+proteins+and+lung+bioactive+peptides.">Pollen proteases compromise the airway epithelial barrier through degradation of transmembrane adhesion proteins and lung bioactive peptides.</a> Allergy. 66, 1088-1098 (2011).</li><li>Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+Pharmaceutical+Aerosol+Deposition+Device+on+Cell+Cultures+(PADDOCC)+to+evaluate+pulmonary+drug+absorption+for+metered+dose+dry+powder+formulations.">A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations.</a> European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e. 77, 132-138 (2011).</li><li>Huttunen, S., Toivanen, M., Arkko, S., Ruponen, M., Tikkanen-Kaukanen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+activity+of+wild+berry+juice+fractions+against+Streptococcus+pneumoniae+binding+to+human+bronchial+cells.">Inhibition activity of wild berry juice fractions against Streptococcus pneumoniae binding to human bronchial cells.</a> Phytotherapy research: PTR. 25, 122-127 (2011).</li><li>Elm, C., Rohde, M., Vaerman, J. P., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+interaction+of+the+pneumococcal+surface+protein+SpsA+with+the+human+polymeric+immunoglobulin+receptor+(hpIgR).">Characterization of the interaction of the pneumococcal surface protein SpsA with the human polymeric immunoglobulin receptor (hpIgR).</a> The Indian journal of medical research. 119, 61-65 (2004).</li><li>Sutherland, T. C., Quattroni, P., Exley, R. M., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcellular+passage+of+Neisseria+meningitidis+across+a+polarized+respiratory+epithelium.">Transcellular passage of Neisseria meningitidis across a polarized respiratory epithelium.</a> Infection and immunity. 78, 3832-3847 (2010).</li><li>Grantham, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation+of+the+influenza+A+virus+M2+protein+is+not+required+for+virus+replication+in+vitro+but+contributes+to+virus+virulence.">Palmitoylation of the influenza A virus M2 protein is not required for virus replication in vitro but contributes to virus virulence.</a> Journal of. 83, 8655-8661 (2009).</li><li>Saedisomeolia, A., Wood, L. G., Garg, M. L., Gibson, P. G., Wark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lycopene+enrichment+of+cultured+airway+epithelial+cells+decreases+the+inflammation+induced+by+rhinovirus+infection+and+lipopolysaccharide.">Lycopene enrichment of cultured airway epithelial cells decreases the inflammation induced by rhinovirus infection and lipopolysaccharide.</a> The Journal of nutritional biochemistry. 20, 577-585 (2009).</li><li>Yoshikawa, T., Hill, T., Li, K., Peters, C. J., Tseng, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+acute+respiratory+syndrome+(SARS)+coronavirus-induced+lung+epithelial+cytokines+exacerbate+SARS+pathogenesis+by+modulating+intrinsic+functions+of+monocyte-derived+macrophages+and+dendritic+cells.">Severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus-induced lung epithelial cytokines exacerbate SARS pathogenesis by modulating intrinsic functions of monocyte-derived macrophages and dendritic cells.</a> Journal of virology. 83, 3039-3048 (2009).</li><li>Yoshikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+innate+immune+responses+of+human+bronchial+epithelial+cells+to+severe+acute+respiratory+syndrome-associated+coronavirus+infection.">Dynamic innate immune responses of human bronchial epithelial cells to severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus infection.</a> PloS one. 5, e8729 (2010).</li><li>Hsu, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+constitutive+type+I+interferon+response+in+bronchial+epithelial+cell+to+influenza+infection.">Critical role of constitutive type I interferon response in bronchial epithelial cell to influenza infection.</a> PloS one. 7, e32947 (2012).</li><li>Harcourt, J. L., Caidi, H., Anderson, L. J., Haynes, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Calu-3+cell+line+as+a+model+of+in+vitro+respiratory+syncytial+virus+infection.">Evaluation of the Calu-3 cell line as a model of in vitro respiratory syncytial virus infection.</a> Journal of virological methods. 174, 144-149 (2011).</li><li>Zhang, L., Peeples, M. E., Boucher, R. C., Collins, P. L., Pickles, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+syncytial+virus+infection+of+human+airway+epithelial+cells+is+polarized,+specific+to+ciliated+cells,+and+without+obvious+cytopathology.">Respiratory syncytial virus infection of human airway epithelial cells is polarized, specific to ciliated cells, and without obvious cytopathology.</a> Journal of virology. 76, 5654-5666 (2002).</li><li>Geys, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+study+of+the+pulmonary+translocation+of+nanoparticles:+a+preliminary+study.">In vitro study of the pulmonary translocation of nanoparticles: a preliminary study.</a> Toxicology letters. 160, 218-226 (2006).</li><li>Geys, J., Nemery, B., Hoet, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+culture+conditions+to+develop+an+in+vitro+pulmonary+permeability+model.">Optimisation of culture conditions to develop an in vitro pulmonary permeability model.</a> Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 21, 1215-1219 (2007).</li><li>Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Calu-3+cells+at+the+air+interface+provides+a+representative+model+of+the+airway+epithelial+barrier.">Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier.</a> Pharmaceutical research. 23, 1482-1490 (2006).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

При установлении Calu-3 LCC вставки в Transwell, клетки не могут поляризовать вообще, либо не могут в полной мере поляризации, как это определено TEER ≥ 1000 Ω × см 2 и ≤ 1% натрия красителя флуоресцеина равновесия между апикальной и базолатеральной отсеков. Кроме того, Calu-3 клеток в LCC может полностью поляризовать, но TEER могут быть несовместимы между измерениями. Хотя колебания TEER измерений Calu-3 LCC нормальные изо дня в день, один раз полностью поляризован, драматические колебания в TEER не ожидается до культура естественно снижается с возрастом, которое может быть всего лишь 5 недель или до тех пор, как 12 недель после посева. Способность Calu-3 LCC для поляризации зависит отчасти от того, как клетки сохраняются и субкультивируют перед использованием в системе Transwell. Клетки, которые выросли за 90% слияния в виде монослоя во время пересева, которые были субкультивируют более чем в 10 раз от замороженных акций, или, что еще не будетан поставляется с свежей среды на регулярной основе, менее вероятно, чтобы полностью поляризуются, и любой поляризации, скорее всего, быстро снижаться. Неполное или полное отсутствие поляризации может также быть связано с изменением материала и размера пор Transwells используется для Calu-3 LCC, и многие-к-много изменений в Transwells аналогичного состава и размера пор также может влиять на поляризацию. Большие размеры пор могут позволить Calu-3 расти через мембрану Transwell в базолатеральной отсека, предотвращая культуры с поляризационным. Отсутствие поляризации может быть также связано с бактериального роста, с указанием дымчатый культуральной среде, что приводит к последующей разбивкой плотных контактов между Calu-3 клетки. Переменная измерений TEER из Calu-3 LCC может быть вызвано механическим нарушений Calu-3 LCC клетки монослоя, вставки, или сами таблички. Средние изменения и TEER измерения должны быть выполнены без наконечников пипеток или электроде приводит касаясь клетки. При выполнении этих операций, следует позаботиться, чтобы избежать введения пузырьков воздуха в апикальной и базолатеральной отсеков, которые будут нарушать способность voltohmmeter обнаружить сопротивление. Способность voltohmmeter для выявления сопротивления в культуре, которая на самом деле поляризованные также может ограничиваться белка отложений на электроде ведет. Этот нарост может быть удалена с нежной шлифовки, или может быть исправлена ​​путем замены электрода. После Calu-3 LCC полностью поляризовать и TEER больше не растет, Calu-3 LCC готовы для использования в качестве модели в пробирке для характеристики хозяин легочного эпителия клеточный ответ на респираторные инфекции. Эта система позволяет лучше характеристику направленности ответов на возбудителей по сравнению с однослойной-культурный легких клеточных линий, традиционно используемые для изучения возбудителей инфекций дыхательных путей, таких как A549 и Нер-2 клеток, с дополнительными преимуществами Calu-3 LCC-байнг более быстрого развиваться, получить легче, и дешевле, чем генерировать первичный, поляризованные, дифференцированные NHBE. Как и в NHBE, поляризованный Calu-3 продемонстрировать плотным строем перехода, и производить муцина. Однако, в отличие NHBE, поляризованный Calu-3 клетки не дифференцируются в слоях базальных клеток и мерцательного цилиндрического эпителия клеток, и несколько поляризованные Calu-3 клетки развиваются реснички выступы 19. Таким образом, хотя полезен для изучения поляризованной реакции дыхательных путей, клетки эпителия дыхательных оскорбление, поляризованные Calu-3 LCC не являются идеальной моделью для изучения развития дыхательных путей или реконструкции в ответ на дыхательную оскорбление или травмы. Слизь производство культивируемых клеток в пробирке могут повлиять на сотовый инфекционной, а также выпуск инфекционного вируса и распространения вируса в поляризованном модели, и прямое сравнение слизи между поляризованными Calu-3 LCC и поляризованные, дифференцированные NHBE не сообщалось . A549 и Нер-2 клеткахповторно легче культуры, чем Calu-3 клетки, однако, в отличие от Calu-3 LCC, они не образуют поляризованные культур при выращивании на вставками Transwell, и, таким образом, не идеальными моделями для изучения в пробирке ответы поляризованных эпителиальных клеток респираторной вирусной инфекцией .

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> РЕАГЕНТЫ </td></tr><tr><td> Calu-3 </td><td> ATCC </td><td> HTB-55 </td><td></td></tr><tr><td> 0,05% трипсина - 0,02% ЭДТА </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> Minimum Essential Орла Средний (EMEM) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 07-00100DK </td><td></td></tr><tr><td> Эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) </td><td> HyClone </td><td> SH30070.03 </td><td> Тепло-инактивации, 56 ° C, 30 мин </td></tr><tr><td> Номера для незаменимых аминокислот 100X (10 мМ) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11140 </td><td> Хранить при температуре 4 ° С в темноте </td></tr><tr><td> L-глютамин </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> EMEM-10% FBS (EMEM-10%) </td><td></td><td></td><td> Дополнение EMEM с инактивированной нагреванием FBS до 10% сыворотки, стерильный фильтр </td></tr><tr><td> EMEM-20% FBS + добавки (EMEM-20% + S) </td><td></td><td></td><td> Дополнение EMEM до конечных концентраций: инактивированной нагреванием FBS, 20%; 1X аминокислот, 2 мМ L-глутамина, 10 мМ HEPES; стерильных фильтров </td></tr><tr><td> 24-а Transwell пластин </td><td> Corning Costar </td><td> 3472 </td><td> 3 мкм, размер пор, полиэстер </td></tr><tr><td> Трипанового синего </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15250 </td><td></td></tr><tr><td> Этанол </td><td> Сигма </td><td> E7023 </td><td> Подготовить до 70%, используя стерильные дН 2 O </td></tr><tr><td> Дульбекко PBS (D-PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14040 </td><td></td></tr><tr><td> Non-флуоресцентный буфер </td><td></td><td></td><td> 118 мм NaCl;4,75 мм KCl, 2,53 мМ CaCl 2 · H 2 O, 2,44 мМ MgSO 4; 1,19 мм KH 2 PO 4, 25 мМ NaHCO 3 в стерильной воде; стерильных фильтров </td></tr><tr><td> Натрий флуоресцеина </td><td> Сигма </td><td> 6377 </td><td> 1 мг / мл в стерильные нефлуоресцентного буфера; стерильным фильтром, защищенном от света месте, хранить при 4 ° C до 6 месяцев </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ОБОРУДОВАНИЕ </td></tr><tr><td> Voltohmmeter </td><td> Инструменты Всемирной Precision </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stx2 электрода </td><td> Инструменты Всемирной Precision </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ELISA ридер </td><td></td><td></td><td> Возможность измерения 486 или 490 </td></tr></tbody></table>

establishing a liquid-covered culture of polarized human airway epithelial calu-3 cells to study host cell response to respiratory pathogens in vitro

Апикальной и базолатеральной поверхности эпителиальных клеток дыхательных путей продемонстрировать направленный ответ на воздействия болезнетворных микроорганизмов в естественных условиях. Таким образом, идеальный в пробирке моделей для изучения клеточных реакций на возбудителей инфекций дыхательных путей поляризуются, образуя апикальной и базальной поверхностей. Одной из таких моделей отличается нормальным человеческим бронхиальные эпителиальные клетки (NHBE). Тем не менее, эта система требует образцы легочной ткани, опыт выделения и культивирования эпителиальных клеток из тканей, и время для создания воздух-жидкость культуры. Calu-3 клетки, полученные из человеческих бронхиальной аденокарциномы, являются альтернативной моделью для изучения реакции проксимального эпителия дыхательных путей клетки дыхательных оскорбление 1, фармакологических соединений 2-6, 7-9 и бактериальных и вирусных патогенов, включая вирус гриппа, риновирусы и тяжелого острого респираторного синдрома - ассоциированный коронавирус 10-14. Недавно Wэлектронной показал, что Calu-3 клетки чувствительны к респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) инфекцией в соответствии с NHBE 15,16. Здесь мы подробно создание поляризованным, покрытые жидкой культуры (LCC) из Calu-3 клетки, ориентируясь на технические подробности выращивания и культивирования Calu-3 клетки, сохраняя клетки, культивированные в LCC, и мы представляем Способ выполнения респираторная вирусная инфекция поляризованного Calu-3 клетки. Чтобы постоянно получать поляризованные Calu-3 LCC, Calu-3 клетки должны быть тщательно субкультивируют до культивирования в Transwell вставками. Calu-3 однослойные культуры должна оставаться ниже 90% слияния, должны быть субкультивируют менее 10 раз из замороженных акций, и должны регулярно снабжаться свежей среде. После культивировали в Transwells, Calu-3 LCC должны быть обработаны с осторожностью. Нерегулярные изменения средствах массовой информации и механические или физические нарушения клеточных слоев или пластин негативно сказаться поляризациинесколько часов или дней. Поляризация контролируется оценки транс-эпителиального электрического сопротивления (TEER) и проверяется путем оценки пассивного уравновешивания флуоресцеина натрия между апикальной и базолатеральной отсеков 17,18. После TEER плато на уровне или выше 1000 Ω × см 2, Calu-3 LCC готовы использовать для изучения клеточных реакций на возбудителей инфекций дыхательных путей.

При выращивании в жидкой покрытой культур (LCC) в системе Transwell культуры, как показано на рисунке 1, Calu-3 клетки поляризуются, развитие различных апикальной и базальной поверхностей. В соответствии с методом, описанным здесь, транс-эпителиального электрического сопротивления (TEER) из Calu-3 LCC достигает плато на уровне или выше 1000 Ω × см 2 в течение 3 недель после посева, пример которой показан на рисунке 2. Плотные соединения образуются между поляризованные клетки предотвращения пассивного уравновешивания малых молекул между апикальной и базолатеральной отсеков. Таким образом, изменение флуоресцеина натрия уравновешивания анализ используется для подтверждения поляризации Calu-3 LCC 15,17,18. Как TEER из Calu-3 монослоя клетки увеличивается в LCC, количество флуоресцеина, что пассивно уравновешивает в базолатеральной отсеке уменьшается. После того, TEER составляет 1000 Ω × см 2, количество флуоресцеина, что уравновешивает вв базолатеральной отсек ≤ 1%, как показано на рисунке 3, поэтому Calu-3 LCC считается полностью поляризован, когда TEER является ≥ 1000 Ω × см 2. Пик измерения TEER из Calu-3 LCC могут отличаться от эксперимента к эксперименту. Однако, как только TEER значения плато для любой эксперимент, полностью поляризован, неинфицированных Calu-3 LCC могут быть стабильными в течение 5 через 12 недель после посева. Отсутствие сопротивления развития в Transwell-культурный Calu-3 может быть вызвано несколькими факторами, как указано в таблице 1. Когда TEER из Calu-3 LCC плато на уровне или выше 1000 Ω × см 2, модель готова быть использован для изучения эпителия дыхательных путей клеточного ответа на возбудителей инфекций дыхательных путей, в том числе респираторно-синцитиальный вирус (RSV). Воздействие RSV приводит к более быстрому снижению в поляризованном целостности культуры по сравнению с макетом заражения клетки (рис. 4). Рисунок 1. Сечение представление Transwell-культуре клеток. Клетки, выращенные на апикальной поверхности пластины мембраны. <img alt="Рисунок 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2.jpg" /> Рисунок 2. Развитие транс-эпителиального электрического сопротивления (TEER) и поляризации Calu-3 после посева клеток в Transwell вставками. В каждый момент времени, TEER представлены как медиана Ω х см 2 ± SEM из 32 независимых скважин одного из представителей эксперимент. <img alt="Рисунок 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3.jpg" /> Рисунок 3. Пассивный равновесия<html> расслоения натрия флуоресцеина в базолатеральной отсек Calu-3 монослоя клетки подавляется, как клетки становятся поляризованными. полезных данных из четырех независимых экспериментов представлены. Каждая точка данных представляет собой отдельное измерение. <img alt="Рисунок 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4.jpg" /> Рисунок 4. RSV инфекции поляризованного Calu-3 LCC ускоряет снижение монослоя целостности. Поляризованных Calu-3 клетки были инфицированы RSV-A2 в МВД = 1 на 0 день, и полярность следили в течение 8 недель после инфицирования. Один из представителей эксперимента. Данные представлены как среднее сопротивление 8 независимых скважин на инфекцию ± SEM в момент времени. * Р &lt;0,05 между макетом и RSV-A2-инфицированных культур, как это определено Стьюдента-тест. способы &quot;&gt; <tbody><tr><td> Вопрос </td><td> Разрешение (ы) </td></tr><tr><td> Сопротивление не поддается измерению </td><td><ul><li> Удалите пузырьки воздуха в скважины </li><li> Используйте Calu-3 клетки, которые были субкультивируют из замороженных складе менее 10 раз </li><li> Не допускайте Calu-3 клетки до достижения 100% слияния в монослой субкультуры </li><li> Убедитесь, что клетки не растут на пластиковые значительно ниже вставки (о том, что клетки могут выросли через поры вставка) </li><li> Позвольте 2-3 недели после посева для полноценного развития сопротивления </li><li> Проверьте состав и размер пор вставки, измените, если это необходимо (рекомендуется вставки полиэстер, 0,3 мкм, размер пор, никаких покрытий, см. материалы для деталей) </li><li> Проверьте качество электрода, шлифование осторожно, чтобы удалить накопившийся белки от кончика, и заменить при необходимости </li><li> Проверьте средой для роста бактерий </li></ul&gt; </td></tr><tr><td> Устойчивость развивается, но полная поляризация (≥ 1000 Ω × см 2) не достигается </td><td><ul><li> Разрешить дополнительное время для поляризации на разработку (иногда может занять до 4 недель) </li><li> Используйте Calu-3 клетки, которые были субкультивируют из замороженных складе менее 10 раз </li><li> Не допускайте Calu-3 клетки до достижения 100% слияния в монослой субкультуры </li><li> Последовательно заменить среды в культурах Transwell, чередующихся между третьим и четвертый день после предыдущего кормления </li><li> Только клетки культуры на вставки, которые размещаются в наружных рядов пластинок </li><li> Используйте другой много вставок Transwell </li></ul></td></tr><tr><td> Клетки полностью поляризовать, но сопротивления не согласуется с одного чтении на следующей </td><td><ul><li> Не нарушать или стек пластин в инкубаторе </li><li> Не вызывают вибрацию в кабинет биобезопасности при Transwell платформыES решаются </li><li> Удалите пузырьки воздуха в скважины </li><li> Не беспокоить слой клеток с наконечников при изменении среды или при выполнении TEER чтениях </li><li> Используйте 200 мкл среды в апикальной отсека; меньший объем может привести к нестабильной показания TEER </li><li> Проверьте качество электрода, шлифование осторожно, чтобы удалить накопившийся белки от кончика, и при необходимости замените </li></ul></td></tr></tbody></table> Таблица 1. Устранение неисправностей проблемы, которые могут возникнуть при культивировании Calu-3 клеток в Transwells. Несколько факторов способствуют полной поляризации Calu-3 клеток в жидкой покрытой культур, наиболее вероятный из которых выделены в таблице.

Watch this Scientific Journal Video about Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro at JoVE.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Результаты и выводы в настоящем докладе, принадлежат авторам и не обязательно отражают точку зрения Центра по контролю и профилактике заболеваний.

Создание жидкого покрытые культуры поляризованный человека эпителия дыхательных путей Calu-3 ячейки по изучению клетки-хозяина в ответ на возбудителей инфекций дыхательных путей<em&gt; В пробирке</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Сотрудничество культуры Модели Синегнойной палочки Биопленки выращенных на живые человеческие клетки дыхательных путей

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Применение Мышь лигируют Патч Пейера Кишечные Пробирной Loop для оценки бактериальной поглощение М клетки

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

<em&gt; В пробирке</em&gt; Модель для изучения гетерогенности человека дифференциации макрофагов и поляризация

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

Человеческие Культуры плацентарной и децидуальной Орган по изучению инфекций на материнской плода интерфейс

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

Разработка слюнных антитела Multiplex иммуноанализа для измерения воздействия на человека окружающей среды патогенам

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Высокая пропускная способность Обнаружение респираторными патогенами в образцах животных с помощью наноразмерных ПЦР

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Сверхэкспрессия и очищение человека<em&gt; Cis</em&gt; -пренилтрансфераза в<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Роман фидер бесплатная система для массового производства мышиных естественных клеток-киллеров в пробирке

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

Мыши и человека, полученных первичных желудка эпителиальных монослойном культивировании для изучения регенерации

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...