Name: the multibac protein complex production platform at the embl
Uploaded: 2013-07-11T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL at JoVE.com

אנו מודים לכריסטוף Bieniossek, סיימון Trowitzsch, דניאל פיצג&#39;רלד, Yuichiro טאקאגי, כריסטיאן Schaffitzel, איבון Hunziker, טימותי ריצ&#39;מונד וכל חברים בעבר ובהווה של המעבדה ברגר לעזרה ועצה. פלטפורמת MultiBac והפיתוח שלה היו ונתמכים בנדיבות על ידי סוכנויות מימון כולל שוויצרי הקרן הלאומית למדע (SNSF), סוכנות הידיעות הלאומית דה משוכלל ונדיר (ANR) והמרכז הלאומי de משוכלל ונדיר Scientifique (CNRS) והנציבות האירופית (EC) במסגרת תוכניות (FP) 6 ו -7. תמיכה בגישה חוצה גבולות מסופקת על ידי FP7 פרויקטי EC P-Cube <a href="http://www.p-cube.eu" target="_blank">(www.p-cube.eu)</a> וBioStruct-X <a href="http://www.biostruct-x.eu" target="_blank">(www.biostruct-x.eu).</a> המשרד הצרפתי למדע הוא הודה במיוחד לתמיכה בפלטפורמת MultiBac בEMBL דרך Investissement d&#39;Avenir פרויקט FRISBI.

1. Recombineering טנדם (CT) ליצירת בונה ביטוי Multigene <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תכנון אסטרטגיית שיתוף הביטוי. גישת תכנון להחדרת גני העניין שלך לתורמי acceptors. submodules הפיזיולוגי המורכב הפוטנציאלי שלך צריך להיות מקובצים יחד על acceptors ותורמים ספציפיים. ...

<ol>
	<li>Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+a+Grip+on+Complexes.">Getting a Grip on Complexes.</a> Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).</li><li>Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+sociology+of+the+cell.">The molecular sociology of the cell.</a> Nature. 450 (7172), 973-982 (2007).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).</li><li>Bieniossek, C., Imasaki, T., Takagi, Y., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiBac:+expanding+the+research+toolbox+for+multiprotein+complexes.">MultiBac: expanding the research toolbox for multiprotein complexes.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (2), 49-57 (2012).</li><li>Fitzgerald, D. J., Berger, P., Schaffitzel, C., Yamada, K., Richmond, T. J., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+complex+expression+by+using+multigene+baculoviral+vectors.">Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors.</a> Nat. Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).</li><li>Bieniossek, C., Richmond, T. J., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiBac:+multigene+baculovirus-based+eukaryotic+protein+complex+production.">MultiBac: multigene baculovirus-based eukaryotic protein complex production.</a> Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 5, Unit 5.20 (2008).</li><li>Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Nie, Y., Garzoni, F., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+baculovirus+expression+tools+for+recombinant+protein+complex+production.">New baculovirus expression tools for recombinant protein complex production.</a> J. Struct. Biol. 172 (1), 45-54 (2010).</li><li>Vijayachandran, L. S., Viola, C., Garzoni, F., Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Chaillet, M., Schaffitzel, C., Busso, D., Romier, C., Poterszman, A., Richmond, T. J., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robots,+pipelines,+polyproteins:+enabling+multiprotein+expression+in+prokaryotic+and+eukaryotic+cells.">Robots, pipelines, polyproteins: enabling multiprotein expression in prokaryotic and eukaryotic cells.</a> J. Struct. Biol. 175 (2), 198-208 (2011).</li><li>Thomas, M. C., Chiang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+general+transcription+machinery+and+general+cofactors.">The general transcription machinery and general cofactors.</a> Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 105-178 (2006).</li><li>Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M., Ban, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+structures+of+the+eukaryotic+ribosome.">Atomic structures of the eukaryotic ribosome.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (5), 189-198 (2012).</li><li>Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+core,+two+shells:+bacterial+and+eukaryotic+ribosomes.">One core, two shells: bacterial and eukaryotic ribosomes.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (6), 560-567 (2012).</li><li>Cramer, P., Bushnell, D. A., Fu, J., Gnatt, A. L., Maier-Davis, B., Thompson, N. E., Burgess, R. R., Edwards, A. M., David, P. R., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+RNA+polymerase+II+and+implications+for+the+transcription+mechanism.">Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism.</a> Science. 288 (5466), 640-649 (2000).</li><li>Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+system+for+heterologous+multiprotein+complexes.">Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes.</a> Nat. Biotechnol. 22 (12), 1583-1587 (2004).</li><li>Bieniossek, C., Nie, Y., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Collinson, I., Romier, C., Berger, P., Richmond, T. J., Steinmetz, M. O., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+unrestricted+multigene+recombineering+for+multiprotein+complex+production.">Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production.</a> Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).</li><li>Nie, Y., Bieniossek, C., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Steinmetz, M. O., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACEMBLing+multigene+expression+constructs+by+recombineering.">ACEMBLing multigene expression constructs by recombineering.</a> Nat. Protocols. , (2009).</li><li>Wasilko, D. J., Lee, S. E., Stutzman-Engwall, K. J., Reitz, B. A., Emmons, T. L., Mathis, K. J., Bienkowski, M. J., Tomasselli, A. G., Fischer, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H.D.+titerless+infected-cells+preservation+and+scale-up+(TIPS)+method+for+large-scale+production+of+NO-sensitive+human+soluble+guanylate+cyclase+(sGC)+from+insect+cells+infected+with+recombinant+baculovirus.">H.D. titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus.</a> Protein Expr. Purif. 65 (2), 122-132 (2009).</li><li>Chao, W. C., Kulkarni, K., Zhang, Z., Kong, E. H., Barford, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+mitotic+checkpoint+complex.">Structure of the mitotic checkpoint complex.</a> Nature. 484 (7393), 208-213 (2012).</li><li>Yamada, K., Frouws, T. D., Angst, B., Fitzgerald, D. J., DeLuca, C., Schimmele, K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+the+chromatin+remodelling+factor+ISW1a.">Structure and mechanism of the chromatin remodelling factor ISW1a.</a> Nature. 472 (7344), 448-453 (2011).</li></ol>

וידאו Snap-יריות באיורים 2 ו -3 ממחישות את התהליך כולו מדור רובוט בסיוע מcDNA ביטוי multigene בונה את כל הדרך לזיהום של תרביות תאי חרקים לייצור חלבון. ריאגנטים חדשים (פלסמידים ווירוס) ופרוטוקולים חזקים פותחו כדי לאפשר לצינור להסתמך על כתיבת נהלים. כל הצנרת כב?...

הפעילות ביולוגית נשלט על ידי אסיפות של חלבונים ויומולקולות אחרות הפועלות בתיאום כדי לזרז פונקציות סלולריות. דוגמאות בולטות ניתן למנות את המנגנון שמעתיק את המידע התורשתי הכלולים בדנ&quot;א לתוך RNA השליח. בבני אדם, יותר מ -100 חלבונים לבוא יחד בתהליך מוגדר ומוסדר לתמלל גנים, ויוצרים מתחמי multiprotein גדולים עם 10 ויותר יחידות משנה כולל RNA פולימראז II ואת גורמי השעתוק הכלליים כגון TFIID, TFIIH ואחרים. 9 דוגמאות נוספות הם הריבוזום, המורכב מהרבה חלבונים ומולקולות רנ&quot;א, שמזרזים סינתזה של חלבון, או מורכב הנקבובית גרעין האחראית על הלוך ביומולקולות דרך מעטפת הגרעין באאוקריוטים. נתיחה ביוכימי ואדריכלית מפורטת של מהות כל מכונות multicomponent בתא היא חיונית כדי להבין את תפקידם. הבהרת המבנה של פרוקריוטים וeukarהריבוזומים yotic, למשל, היוו סימן ההיכר אירועים מניבים תובנה חסרת תקדים לתוך כמה מכונות macromolecular אלה לבצע את התפקיד המיועד שלהם בתא. 10,11 ניתן להשיג הריבוזומים באיכות ובכמות מספיקות למחקר מפורט על ידי מטהר את חומר אנדוגני מהתאים בתרבית, בשל העובדה כי עד 30% מהמסה התאית מורכבת של הריבוזומים. RNA פולימראז II הוא כבר פחות נפוץ בסדרי גודל, והרבה אלף ליטרים של תרבית שמרים הייתי צריך להיות מעובד כדי לקבל תצוגה מפורטת של האטום מורכב חיוני זה מרכזי לשעתוק. 12 רובם המכריע של מתחמים החיוניים האחרים נמצאים באולם סכומים נמוכים בהרבה בתאים מקומיים, ולכן לא יכולים להיות מטוהרים במידה מספקת ממקור חומר מקורי. כדי להבהיר מתחמים כאלה נגישים לניתוח מבני ותפקודי מפורט דורש ייצור Heterologous באמצעות te רקומביננטיchniques. היה לי ייצור חלבון רקומביננטי השפעה גדולה על מחקר במדעי חיים. חלבונים רבים יוצרו recombinantly, והמבנה והתפקוד שלהם גזורים ברזולוציה גבוהה. תוכניות גנומיקה מבניות ניצלו ההבהרה את הגנום של אורגניזמים רבים כדי לטפל ברפרטואר מוצר הגן של אורגניזמים שלמים במצב תפוקה גבוהה (HT). אלפי מבנים חלבוניים יש בכך נקבעו. עד כה, המערכת הנפוצה ביותר prolifically לייצור חלבון רקומביננטי כבר E. coli, ומערכות ביטוי רבות פותחו ושוכללו במשך השנים לייצור Heterologous בשורה זו. פלסמידים מחסה שפע של פונקציות כדי לאפשר ייצור חלבון בE. coli למלא קטלוגים שלמים של ספקים מסחריים. עם זאת, א &#39; יש coli מגבלות מסוימות שהופכות אותו מתאימה לייצור חלבונים אוקריוטים רבים ובעמ &#39;קומפלקסי חלבונים במפרק עם יחידות משנה רבות. לכן, ייצור חלבון במארחים אוקריוטים הפך יותר ויותר את שיטת הבחירה בשנים האחרונות. מערכת המתאימה במיוחד היטב כדי לייצר חלבונים אוקריוטים היא מערכת וקטור baculovirus הביטוי (BEVS) המסתמכת על baculovirus רקומביננטי נושא את הגנים Heterologous להדביק תרביות תאי חרקים שגדלו במעבדה. מערכת MultiBac היא BEVS פותחה לאחרונה המותאמים במיוחד לייצור של קומפלקסי חלבונים אוקריוטים עם יחידות משנה רבות (איור 1). MultiBac הוצג לראשונה בשנת 2004. -13 מאז השקתו, MultiBac שוכלל ברציפות והזרם בשורה כדי לפשט את הטיפול, לשפר את איכות חלבון המטרה, ובדרך כלל מה שהופך את המערכת נגישה למשתמשים שאינם מומחים על ידי עיצוב נהלי עבודה סטנדרטי (SOPs יעילים). 4 MultiBac יושם במעבדות רבות ברחבי העולם, בACademia ותעשייה. בEMBL בגרנובל, תוכניות לגישה רב לאומיים היו לשים במקום על ידי הנציבות האירופית לספק הכשרה מקצועית בפלטפורמת MultiBac למדענים, שבקשו להשתמש במערכת הייצור הזה לקידום המחקר שלהם. המבנה והתפקוד של קומפלקסי חלבונים רבים שהיו עד כה לא היו נגישים הובהרו על ידי שימוש בדגימות המיוצרות עם MultiBac. 4 בחלק הבא, את הצעדים החיוניים של ייצור MultiBac מסוכמים בפרוטוקולים כפי שהם במבצע במתקן MultiBac ב EMBL גרנובל.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bluo-Gal</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15519-028 (1 g)</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tetracycline</td>
 <td>Euromedex</td>
 <td>UT2965-B (25 g)</td>
 <td>1,000X at 10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kanamycine</td>
 <td>Euromedex</td>
 <td>EU0420 (25 g)</td>
 <td>1,000X at 50 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gentamycine</td>
 <td>SIGMA</td>
 <td>G3632 (5 g)</td>
 <td>1,000X at 10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Euromedex</td>
 <td>EU0008-B (5 g)</td>
 <td>1,000X at 1M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cre-recombinase</td>
 <td>New England BioLabs</td>
 <td>M0298</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>X-Treme GENE HP transfection reagent</td>
 <td>Roche</td>
 <td>06 366 236 001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hyclone SFM4 Insect</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH 30913.02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-well plate Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>353046</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357507</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357543</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357551</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357535</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357550</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml tube Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>352070</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml tube Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>352096</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.8 ml cryotube Nunc</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>55005</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100 ml shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211917</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>250 ml shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211918</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>500 ml shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211919</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 L shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211921</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Certomat Orbital Shaker + plateau</td>
 <td>Sartorius</td>
 <td>4445110, 4445233</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Liquid nitrogen tank dewar 35 L</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>M76801</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biological Safety Cabinet Faster</td>
 <td>Sodipro</td>
 <td>FASV20000606</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical Microscope</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>451207</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sf21 Insect cells</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hi5 Insect cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>B855-02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tecan freedom EVO running Evoware plus</td>
 <td>TECAN</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 &mu;l conductive tips (black),</td>
 <td>TECAN</td>
 <td>10 612 516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>200 &mu;l conductive tips (black)</td>
 <td>TECAN</td>
 <td>10 612 510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>disposable trough for reagents, 100 ml</td>
 <td>TECAN</td>
 <td>10 613 049</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>twin.tec PCR plate 96, skirted</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>0030 128.648</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 well V bottom, non sterile</td>
 <td>BD falcon</td>
 <td>353263</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 deepwell plate color natural, PP)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>M3752M</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PS microplate, 96 well flat bottom</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>655101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 deepwell plate</td>
 <td>Thermo scientific</td>
 <td>AB-0932</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>24 well blocks RB</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>19583</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DpnI restriction enzyme</td>
 <td>NEB</td>
 <td>R0176L</td>
 <td>20 U/uL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NEBuffer 4 10X</td>
 <td>NEB</td>
 <td>B7004S</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2X phusion mastermix HF</td>
 <td>Finnzyme</td>
 <td>ref F-531L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2X phusion mastermix GC</td>
 <td>Finnzyme</td>
 <td>ref F-532L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DGLB 1.5X</td>
 <td>homemade</td>
 <td></td>
 <td>7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High DNA Mass Ladder for e-gel</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>10496-016</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low DNA Mass Ladder for e-gel</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>10068-013</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-gel 48 1% agarose GP</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>G8008-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit</td>
 <td>Macherey Nagel</td>
 <td>740 708.24</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract</td>
 <td>Macherey Nagel</td>
 <td>740 707.2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gotaq green master mix</td>
 <td>Promega</td>
 <td>M7113</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>T4 DNA polymerase, LIC-qualified</td>
 <td>Novagen</td>
 <td>70099-3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT 100 mM</td>
 <td>homemade</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Urea 2 M</td>
 <td>homemade</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA 500 mM pH 8.0</td>
 <td>Homemade</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LB broth (Miller) 500 g</td>
 <td>Athena ES</td>
 <td>103</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

the multibac protein complex production platform at the embl

Proteomics מחקר חשף את המורכבות מרשימות של proteomes אוקריוטים בפירוט חסר תקדים. עכשיו זה רעיון מקובל שבעיקר חלבונים בתאים לא קיימים כישויות בודדות אלא להפעיל את הפעילות הביולוגית שלהם בשיתוף עם הרבה חלבונים אחרים, בבני אדם עשרה או יותר, ויוצרים קווי הרכבה בתא עבור רוב אם לא את כל הפונקציות החיוניות. 1 , 2 ידע של הפונקציה והאדריכלות של מכלולי multiprotein אלה מחייב מתן שלהם באיכות מעולה ובכמות מספקת לניתוח מפורט. מיעוט של קומפלקסי חלבונים רבים בתאים, במיוחד באאוקריוטים, אוסר על חילוצם ממקורות מקומיים, ומחייב ייצור רקומביננטי. מערכת וקטור ביטוי baculovirus (BEVS) הוכיחה להיות שימושי במיוחד עבור ייצור חלבונים אוקריוטים, הפעילות אשר לעתים קרובות מסתמכת על עיבוד שלאחר translational כי מערכות ביטוי נפוצות אחרות לעתים קרובות יכולהלא תומך. 3 BEVS להשתמש baculovirus רקומביננטי שלתוכו הגן של עניין הוכנס להדביק תרביות תאי חרקים אשר בתורו מייצרים את החלבון של בחירה. MultiBac הוא BEVS כי כבר מותאם במיוחד לייצור של קומפלקסי חלבונים אוקריוטים המכילים יחידות משנה רבות. 4 תנאי חיוני לייצור יעיל של חלבונים והקומפלקסים שלהם הם פרוטוקולים חזקים לכל המעורבים בניסוי שביטוי אידיאלי יכול להיות מיושם כצעדים נהלים סטנדרטיים (SOPs הפעלה) ולאחר מכן גם על ידי משתמשים שאינם מומחים בקלות יחסית. פלטפורמת MultiBac בביולוגיה המולקולרית המעבדה האירופית (EMBL) משתמשת בכתיבת נהלים לכל המעורבים בניסוי ביטוי מורכב multiprotein השלבים, החל מהחדרת הגנים לתוך הגנום baculoviral מהונדס מותאם למאפייני ייצור חלבון Heterologous לניתוח בקנה מידה קטנה של החלבון דגימות הופקו. 5-8 הפלטפורמהמותקן במצב פתוח גישה בEMBL גרנובל ותמך במדענים רבים מהאקדמיה ומהתעשייה להאצת פרויקטים של מחקר מורכב חלבון.

שיתוף ביטוי חזק של חלבוני Heterologous שהושגו על ידי מערכת MultiBac מוצג באיור 1D (בדיקות שנלקחו 48 שעות לאחר הדבקת תרבית תאי השעיה). להקות חלבון overexpressed הם בבירור להבחין בכל תמצית התא (SNP) וlysate פינה (SN). האיכות והכמות של חומר החלבון המיוצר היא לעתים קרובות מספיק כדי לאפשר ק...

Watch this Scientific Journal Video about The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL at JoVE.com

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

קומפלקסי חלבונים לזרז תפקודים תאיים מרכזיים. אפיון פונקציונלי והמבני מפורט של מתחמים רבים חיוניים דורש ייצור רקומביננטי. MultiBac הוא מערכת תא baculovirus / חרק מותאם במיוחד לביטוי חלבונים אוקריוטים והמתחמים שלהם. MultiBac יושם כפלטפורמת גישה פתוחה, ונהלי עבודה סטנדרטיים שפותחו על מנת למקסם את התועלת שלו.

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Research

JoVE Journal

Biology

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

Dissection ברוטו של קיבה של לובסטר, Homarus Americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

באמצעות מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה על ההיפוך חלוקה משקל מבוסס מולקולרית עם שלב החילוץ נוזלי

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

הפקה של microarrays רקמות, צביעה אימונוהיסטוכימיה ו דיגיטציה בתוך אטלס החלבון האנושי

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

פלטפורמת ביטוי נוח כללי לייצור חלבונים המופרשים מ תאים אנושיים

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

היגיון, שלבים ניסיוניים, והפוטנציאל של יוסינתזה מוצרים הטבעי Heterologous מציע אריתרומיצין האנטיביוטי הקומפלקס הופק באמצעות<em&gt; א coli</em

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities.  It is ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Culturing של אדם תאי אפיתל באף בממשק האוויר הנוזלי

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

כמותי Immunofluorescence Assay למדוד הווריאציה ברמות חלבון בCentrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

פרוטוקול מעוקב מדמיין ביטוי החלבון ברזולוציה תא יחיד תכשירים לעור הר שלם

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...