Name: the multibac protein complex production platform at the embl
Uploaded: 2013-07-11T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL at JoVE.com

Agradecemos Christoph Bieniossek, Simon Trowitzsch, Daniel Fitzgerald, Yuichiro Takagi, Christiane Schaffitzel, Yvonne Hunziker, Timothy Richmond e todos os membros atuais e anteriores do laboratório de Berger para ajuda e conselhos. A plataforma MultiBac e seu desenvolvimento têm sido e são generosamente apoiados por agências de financiamento, incluindo a Swiss National Science Foundation (SNSF), a Agence National de Recherche (ANR) e do Centre National de Recherche Scientifique (CNRS) e da Comissão Europeia (CE) em programas-quadro (FP) 6 e 7. Apoio ao acesso transnacional é fornecido pelos projetos FP7 CE P-CUBE ( <a href="http://www.p-cube.eu" target="_blank">www.p-cube.eu</a> ) e BioStruct-X ( <a href="http://www.biostruct-x.eu" target="_blank">www.biostruct-x.eu</a> ). O Ministério da Ciência é particularmente reconhecido por apoiar a plataforma MultiBac no EMBL através do Investissement d&#39;Avenir projeto Frisbi.

1. Tandem recombineering (TR) para a criação de MultiGene construções de expressão <ol><li> Planejando a estratégia de co-expressão. Abordagem de projeto para inserir seus genes de interesse em doadores e receptores. Submódulos fisiológicas potenciais de seu complexo devem ser agrupadas em Aceitantes e Doadores específicas. Use Module multiplicação composta por endonuclease Homing (HE) - pares BstXI combinar cassetes de expressão em doador individual e plasmídeos Acceptor 7,8 ...

<ol>
	<li>Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+a+Grip+on+Complexes.">Getting a Grip on Complexes.</a> Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).</li><li>Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+sociology+of+the+cell.">The molecular sociology of the cell.</a> Nature. 450 (7172), 973-982 (2007).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).</li><li>Bieniossek, C., Imasaki, T., Takagi, Y., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiBac:+expanding+the+research+toolbox+for+multiprotein+complexes.">MultiBac: expanding the research toolbox for multiprotein complexes.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (2), 49-57 (2012).</li><li>Fitzgerald, D. J., Berger, P., Schaffitzel, C., Yamada, K., Richmond, T. J., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+complex+expression+by+using+multigene+baculoviral+vectors.">Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors.</a> Nat. Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).</li><li>Bieniossek, C., Richmond, T. J., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiBac:+multigene+baculovirus-based+eukaryotic+protein+complex+production.">MultiBac: multigene baculovirus-based eukaryotic protein complex production.</a> Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 5, Unit 5.20 (2008).</li><li>Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Nie, Y., Garzoni, F., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+baculovirus+expression+tools+for+recombinant+protein+complex+production.">New baculovirus expression tools for recombinant protein complex production.</a> J. Struct. Biol. 172 (1), 45-54 (2010).</li><li>Vijayachandran, L. S., Viola, C., Garzoni, F., Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Chaillet, M., Schaffitzel, C., Busso, D., Romier, C., Poterszman, A., Richmond, T. J., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robots,+pipelines,+polyproteins:+enabling+multiprotein+expression+in+prokaryotic+and+eukaryotic+cells.">Robots, pipelines, polyproteins: enabling multiprotein expression in prokaryotic and eukaryotic cells.</a> J. Struct. Biol. 175 (2), 198-208 (2011).</li><li>Thomas, M. C., Chiang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+general+transcription+machinery+and+general+cofactors.">The general transcription machinery and general cofactors.</a> Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 105-178 (2006).</li><li>Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M., Ban, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+structures+of+the+eukaryotic+ribosome.">Atomic structures of the eukaryotic ribosome.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (5), 189-198 (2012).</li><li>Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+core,+two+shells:+bacterial+and+eukaryotic+ribosomes.">One core, two shells: bacterial and eukaryotic ribosomes.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (6), 560-567 (2012).</li><li>Cramer, P., Bushnell, D. A., Fu, J., Gnatt, A. L., Maier-Davis, B., Thompson, N. E., Burgess, R. R., Edwards, A. M., David, P. R., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+RNA+polymerase+II+and+implications+for+the+transcription+mechanism.">Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism.</a> Science. 288 (5466), 640-649 (2000).</li><li>Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+system+for+heterologous+multiprotein+complexes.">Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes.</a> Nat. Biotechnol. 22 (12), 1583-1587 (2004).</li><li>Bieniossek, C., Nie, Y., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Collinson, I., Romier, C., Berger, P., Richmond, T. J., Steinmetz, M. O., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+unrestricted+multigene+recombineering+for+multiprotein+complex+production.">Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production.</a> Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).</li><li>Nie, Y., Bieniossek, C., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Steinmetz, M. O., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACEMBLing+multigene+expression+constructs+by+recombineering.">ACEMBLing multigene expression constructs by recombineering.</a> Nat. Protocols. , (2009).</li><li>Wasilko, D. J., Lee, S. E., Stutzman-Engwall, K. J., Reitz, B. A., Emmons, T. L., Mathis, K. J., Bienkowski, M. J., Tomasselli, A. G., Fischer, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H.D.+titerless+infected-cells+preservation+and+scale-up+(TIPS)+method+for+large-scale+production+of+NO-sensitive+human+soluble+guanylate+cyclase+(sGC)+from+insect+cells+infected+with+recombinant+baculovirus.">H.D. titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus.</a> Protein Expr. Purif. 65 (2), 122-132 (2009).</li><li>Chao, W. C., Kulkarni, K., Zhang, Z., Kong, E. H., Barford, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+mitotic+checkpoint+complex.">Structure of the mitotic checkpoint complex.</a> Nature. 484 (7393), 208-213 (2012).</li><li>Yamada, K., Frouws, T. D., Angst, B., Fitzgerald, D. J., DeLuca, C., Schimmele, K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+the+chromatin+remodelling+factor+ISW1a.">Structure and mechanism of the chromatin remodelling factor ISW1a.</a> Nature. 472 (7344), 448-453 (2011).</li></ol>

Vídeo instantâneos nas Figuras 2 e 3 ilustram o processo inteiro de produção assistida por robô a partir do cDNA de expressão constrói multigenes todo o caminho para a infecção de culturas de células de insectos para a produção de proteína. Novos reagentes (plasmídeos e vírus) e os protocolos robustos têm sido desenvolvidos para permitir que uma conduta depender de PHF. Todo o oleoduto tem sido implementado como uma tecnologia de plataforma na EMBL, em Grenoble. A plataf...

A actividade biológica é controlada pela montagem de proteínas e outras biomoléculas que agem em conjunto para catalisar as funções celulares. Exemplos notáveis ​​incluem a maquinaria que transcreve a informação hereditária contida no DNA em RNA mensageiro. Nos seres humanos, mais de 100 proteínas em conjunto com um processo definido e regulado para transcrever os genes, formando grandes complexos multiproteicos com 10 e mais subunidades, incluindo a RNA polimerase II e os factores de transcrição gerais, como TFIID, TFIIH e outros. 9 Outros exemplos são o ribossoma, que consiste em muitas proteínas e moléculas de ARN que catalisa a síntese de proteínas, ou o complexo do poro nuclear, que é responsável pelo transporte biomoléculas através do envelope nuclear em eucariotas. A dissecção de arquitetura e bioquímica detalhada de essencialmente todas as máquinas com múltiplos componentes da célula é vital para compreender a sua função. A elucidação da estrutura de procariotas e eukarribossomos yotic, por exemplo, constituíram eventos marcantes produzindo uma visão sem precedentes sobre a forma como estas máquinas macromoleculares realizar suas funções designadas na célula 10,11. Os ribossomas podem ser obtidos em termos de qualidade e quantidade suficientes para um estudo detalhado por purificação do material endógeno a partir de células cultivadas, devido ao fato de que até 30% da massa celular consiste de ribossomas. RNA polimerase II já é menos abundante em ordens de magnitude e, em muitos milhares de litros de cultura de levedura teve de ser processada para se obter uma vista atómica detalhada deste complexo central e essencial para a transcrição. 12 A esmagadora maioria dos outros complexos essenciais estão presentes no entanto quantidades muito baixas em células nativas, e, portanto, não pode ser purificada de forma adequada a partir de material de origem nativa. Para produzir tais complexos acessíveis à análise estrutural e funcional detalhada exige a produção heteróloga recombinante usando TEchniques. Produção de proteínas recombinantes teve um grande impacto na pesquisa de ciências da vida. Muitas proteínas foram produzidos de forma recombinante, e a sua estrutura e função dissecado na alta resolução. Programas de genômica estrutural aproveitaram a elucidação dos genomas de muitos organismos para enfrentar o repertório de organismos inteiros no modo de alto rendimento (HT), produto do gene. Milhares de estruturas proteicas foram assim determinados. Até à data, o sistema mais usado para prolífica produção de proteínas recombinantes tem sido E. coli, e diversos sistemas de expressão têm sido desenvolvidos e refinada ao longo dos anos, para a produção heteróloga neste hospedeiro. Os plasmídeos contendo uma variedade de funcionalidades, para permitir a produção de proteínas em E. coli preencher catálogos inteiros de provedores comerciais. No entanto, E. coli tem certas limitações que o tornam inadequado para a produção de muitas proteínas eucarióticas e em pcomplexos de proteínas articulares com várias subunidades. Por conseguinte, a produção de proteínas em hospedeiros eucarióticos tornou-se cada vez mais o método de escolha nos últimos anos. Um sistema particularmente bem adequado para a produção de proteínas eucarióticas é o sistema de vector de expressão de baculovirus (BEVS) que depende de um baculovírus recombinante portador dos genes heterólogos para infectar culturas de células de insectos cultivadas em laboratório. O sistema é um MultiBac BEVS desenvolvidos mais recentemente, que é particularmente adaptado para a produção de complexos de proteínas eucarióticas com várias subunidades (figura 1). MultiBac foi introduzido pela primeira vez em 2004. 13 Desde a sua introdução, MultiBac tem sido continuamente refinado e fluxo alinhada para simplificar a manipulação, melhorar a qualidade da proteína-alvo e, geralmente, tornando o sistema acessível a usuários não especialistas através da concepção de procedimentos operacionais padronizados (POPs eficientes). 4 MultiBac foi implementada em muitos laboratórios em todo o mundo, em acAdémia e indústria. No EMBL em Grenoble, programas de acesso transnacionais foram postas em prática pela Comissão Europeia para fornecer treinamento especializado na plataforma MultiBac para cientistas que pretendiam usar este sistema de produção para avançar suas pesquisas. A estrutura e função de muitos complexos de proteínas, que até agora não eram acessíveis foi elucidada utilizando amostras produzidas com MultiBac. 4 No seguinte, as etapas de produção essenciais MultiBac estão resumidos nos protocolos como estão em operação na instalação MultiBac no EMBL Grenoble.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bluo-Gal</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15519-028 (1 g)</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tetracycline</td>
 <td>Euromedex</td>
 <td>UT2965-B (25 g)</td>
 <td>1,000X at 10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kanamycine</td>
 <td>Euromedex</td>
 <td>EU0420 (25 g)</td>
 <td>1,000X at 50 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gentamycine</td>
 <td>SIGMA</td>
 <td>G3632 (5 g)</td>
 <td>1,000X at 10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Euromedex</td>
 <td>EU0008-B (5 g)</td>
 <td>1,000X at 1M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cre-recombinase</td>
 <td>New England BioLabs</td>
 <td>M0298</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>X-Treme GENE HP transfection reagent</td>
 <td>Roche</td>
 <td>06 366 236 001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hyclone SFM4 Insect</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH 30913.02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-well plate Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>353046</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357507</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357543</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357551</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357535</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357550</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml tube Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>352070</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml tube Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>352096</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.8 ml cryotube Nunc</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>55005</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100 ml shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211917</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>250 ml shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211918</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>500 ml shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211919</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 L shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211921</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Certomat Orbital Shaker + plateau</td>
 <td>Sartorius</td>
 <td>4445110, 4445233</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Liquid nitrogen tank dewar 35 L</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>M76801</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biological Safety Cabinet Faster</td>
 <td>Sodipro</td>
 <td>FASV20000606</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical Microscope</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>451207</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sf21 Insect cells</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hi5 Insect cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>B855-02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tecan freedom EVO running Evoware plus</td>
 <td>TECAN</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 &mu;l conductive tips (black),</td>
 <td>TECAN</td>
 <td>10 612 516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>200 &mu;l conductive tips (black)</td>
 <td>TECAN</td>
 <td>10 612 510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>disposable trough for reagents, 100 ml</td>
 <td>TECAN</td>
 <td>10 613 049</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>twin.tec PCR plate 96, skirted</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>0030 128.648</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 well V bottom, non sterile</td>
 <td>BD falcon</td>
 <td>353263</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 deepwell plate color natural, PP)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>M3752M</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PS microplate, 96 well flat bottom</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>655101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 deepwell plate</td>
 <td>Thermo scientific</td>
 <td>AB-0932</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>24 well blocks RB</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>19583</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DpnI restriction enzyme</td>
 <td>NEB</td>
 <td>R0176L</td>
 <td>20 U/uL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NEBuffer 4 10X</td>
 <td>NEB</td>
 <td>B7004S</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2X phusion mastermix HF</td>
 <td>Finnzyme</td>
 <td>ref F-531L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2X phusion mastermix GC</td>
 <td>Finnzyme</td>
 <td>ref F-532L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DGLB 1.5X</td>
 <td>homemade</td>
 <td></td>
 <td>7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High DNA Mass Ladder for e-gel</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>10496-016</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low DNA Mass Ladder for e-gel</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>10068-013</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-gel 48 1% agarose GP</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>G8008-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit</td>
 <td>Macherey Nagel</td>
 <td>740 708.24</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract</td>
 <td>Macherey Nagel</td>
 <td>740 707.2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gotaq green master mix</td>
 <td>Promega</td>
 <td>M7113</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>T4 DNA polymerase, LIC-qualified</td>
 <td>Novagen</td>
 <td>70099-3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT 100 mM</td>
 <td>homemade</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Urea 2 M</td>
 <td>homemade</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA 500 mM pH 8.0</td>
 <td>Homemade</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LB broth (Miller) 500 g</td>
 <td>Athena ES</td>
 <td>103</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

the multibac protein complex production platform at the embl

Proteômica pesquisa revelou a complexidade impressionante de proteomas eucarióticas em detalhes sem precedentes. É agora um conceito geralmente aceite de que as proteínas nas células principalmente não existem como entidades isoladas, mas exercem a sua actividade biológica, em associação com muitas outras proteínas, em seres humanos dez ou mais, formando as linhas de montagem na célula para a maior parte, se não todas as funções vitais. 1 , 2 Conhecimento da função e arquitetura destes conjuntos multiprotein requer sua prestação em qualidade superior e quantidade suficiente para uma análise detalhada. A escassez de muitos complexos de proteínas nas células, em particular em eucariotas, impede a sua extracção a partir de fontes nativas, e requer a produção recombinante. O sistema de vector de expressão de baculovirus (BEVS) provou ser particularmente útil para a produção de proteínas eucarióticas, a actividade da qual assenta o processamento pós-translacional que outros sistemas de expressão vulgarmente utilizados, muitas vezes podenão suporta. três BEVS usar um baculovirus recombinante no qual o gene de interesse foi introduzido para infectar culturas de células de insectos, que por sua vez produzem a proteína de escolha. MultiBac BEVS é um que foi especialmente adaptado para a produção de complexos de proteínas eucarióticas que contêm várias subunidades. 4 Um pré-requisito importante para a produção eficiente de proteínas e os seus complexos são protocolos robustos para todos os passos envolvidos na expressão de uma experiência que, idealmente, pode ser implementado como procedimentos operacionais padronizados (POPs) e seguido também por usuários não-especializados, com relativa facilidade. A plataforma MultiBac no Laboratório de Biologia Molecular Europeu (EMBL) utiliza PHF para todos os passos envolvidos na expressão de um complexo multiproteico experiência, começando a partir da inserção dos genes num genoma de baculovírus engenharia optimizado para as propriedades de produção de proteínas heterólogas a análise de pequena escala da proteína exemplares produzidos. 5-8 a plataformaestá instalado em um modo de acesso aberto no EMBL Grenoble e apoiou muitos cientistas de universidades e empresas para acelerar projetos de pesquisa complexos protéicos.

Forte co-expressão de proteínas heterólogas obtidas pelo sistema MultiBac é mostrado na Figura 1D (sondas feita 48 horas após a infecção de uma cultura de células em suspensão). As bandas de proteína overexpressed são claramente discerníveis no extracto de células inteiras (SNP) e o ligado clarificado (SN). A qualidade e quantidade do material de proteína produzida é muitas vezes suficiente, para permitir a determinação da estrutura dos complexos de proteína, tais como o ponto de verif...

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The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Complexos proteína de catalisar as funções celulares importantes. Caracterização estrutural e funcional detalhada de muitos complexos essenciais exige a produção recombinante. MultiBac é um sistema de células de baculovirus / insecto particularmente adaptado para a expressão de proteínas eucarióticas e seus complexos. MultiBac foi implementado como uma plataforma de acesso aberto, e procedimentos operacionais padrão desenvolvidos para maximizar a sua utilidade.

A Plataforma de Produção de Proteína Complexo MultiBac no EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

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A Lógica, etapas experimentais, e potencial de Biossíntese produto heteróloga Natural Apresentando o complexo antibiótico eritromicina Um produzido através<em&gt; E. coli</em

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities.  It is ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

A cultura de células epiteliais nasais Humano na interface ar líquido

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Quantitative Reação de Imunofluorescência Indireta para medir a variação nos níveis de proteína no centrossomas

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

Protocolo CUBIC Visualiza Protein Expression na resolução única célula em preparações e peles, inteiros Mount

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...