Name: the multibac protein complex production platform at the embl
Uploaded: 2013-07-11T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL at JoVE.com

Мы благодарим Кристоф Bieniossek, Саймон Trowitzsch, Даниэль Фицджеральд, Yuichiro Такаги, Кристиан Schaffitzel, Ивонн Хунцикера, Тимоти Ричмонд и всех прошлых и настоящих членов лаборатории Бергер за помощью и советом. MultiBac платформы и ее развития были и при щедрой поддержке финансирования учреждений, включая Швейцарского национального научного фонда (SNSF), Национального агентства по исследованиям (ANR) и Национального центра Научных Исследований (CNRS) и Европейская комиссия (ЕК) В рамочной программы (FP) 6 и 7. Поддержка транснационального доступа обеспечивается проектов ЕС FP7 P-CUBE ( <a href="http://www.p-cube.eu" target="_blank">www.p-cube.eu</a> ) и BioStruct-X ( <a href="http://www.biostruct-x.eu" target="_blank">www.biostruct-x.eu</a> ). Французское министерство науки, в частности, признал за поддержку MultiBac платформы на EMBL через Investissement d&#39;Avenir Frisbi проекта.

1. Тандем Recombineering (TR) для создания конструкций Multigene Выражение <ol><li> Планирование совместной экспрессии стратегии. Проектный подход для вставки вашего интерес генов в доноры и акцепторы. Потенциальные физиологические подмодулей вашего комплекса должны быть сгруппированы по ?...

<ol>
	<li>Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+a+Grip+on+Complexes.">Getting a Grip on Complexes.</a> Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).</li><li>Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+sociology+of+the+cell.">The molecular sociology of the cell.</a> Nature. 450 (7172), 973-982 (2007).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).</li><li>Bieniossek, C., Imasaki, T., Takagi, Y., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiBac:+expanding+the+research+toolbox+for+multiprotein+complexes.">MultiBac: expanding the research toolbox for multiprotein complexes.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (2), 49-57 (2012).</li><li>Fitzgerald, D. J., Berger, P., Schaffitzel, C., Yamada, K., Richmond, T. J., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+complex+expression+by+using+multigene+baculoviral+vectors.">Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors.</a> Nat. Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).</li><li>Bieniossek, C., Richmond, T. J., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiBac:+multigene+baculovirus-based+eukaryotic+protein+complex+production.">MultiBac: multigene baculovirus-based eukaryotic protein complex production.</a> Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 5, Unit 5.20 (2008).</li><li>Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Nie, Y., Garzoni, F., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+baculovirus+expression+tools+for+recombinant+protein+complex+production.">New baculovirus expression tools for recombinant protein complex production.</a> J. Struct. Biol. 172 (1), 45-54 (2010).</li><li>Vijayachandran, L. S., Viola, C., Garzoni, F., Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Chaillet, M., Schaffitzel, C., Busso, D., Romier, C., Poterszman, A., Richmond, T. J., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robots,+pipelines,+polyproteins:+enabling+multiprotein+expression+in+prokaryotic+and+eukaryotic+cells.">Robots, pipelines, polyproteins: enabling multiprotein expression in prokaryotic and eukaryotic cells.</a> J. Struct. Biol. 175 (2), 198-208 (2011).</li><li>Thomas, M. C., Chiang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+general+transcription+machinery+and+general+cofactors.">The general transcription machinery and general cofactors.</a> Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 105-178 (2006).</li><li>Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M., Ban, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+structures+of+the+eukaryotic+ribosome.">Atomic structures of the eukaryotic ribosome.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (5), 189-198 (2012).</li><li>Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+core,+two+shells:+bacterial+and+eukaryotic+ribosomes.">One core, two shells: bacterial and eukaryotic ribosomes.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (6), 560-567 (2012).</li><li>Cramer, P., Bushnell, D. A., Fu, J., Gnatt, A. L., Maier-Davis, B., Thompson, N. E., Burgess, R. R., Edwards, A. M., David, P. R., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+RNA+polymerase+II+and+implications+for+the+transcription+mechanism.">Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism.</a> Science. 288 (5466), 640-649 (2000).</li><li>Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+system+for+heterologous+multiprotein+complexes.">Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes.</a> Nat. Biotechnol. 22 (12), 1583-1587 (2004).</li><li>Bieniossek, C., Nie, Y., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Collinson, I., Romier, C., Berger, P., Richmond, T. J., Steinmetz, M. O., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+unrestricted+multigene+recombineering+for+multiprotein+complex+production.">Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production.</a> Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).</li><li>Nie, Y., Bieniossek, C., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Steinmetz, M. O., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACEMBLing+multigene+expression+constructs+by+recombineering.">ACEMBLing multigene expression constructs by recombineering.</a> Nat. Protocols. , (2009).</li><li>Wasilko, D. J., Lee, S. E., Stutzman-Engwall, K. J., Reitz, B. A., Emmons, T. L., Mathis, K. J., Bienkowski, M. J., Tomasselli, A. G., Fischer, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H.D.+titerless+infected-cells+preservation+and+scale-up+(TIPS)+method+for+large-scale+production+of+NO-sensitive+human+soluble+guanylate+cyclase+(sGC)+from+insect+cells+infected+with+recombinant+baculovirus.">H.D. titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus.</a> Protein Expr. Purif. 65 (2), 122-132 (2009).</li><li>Chao, W. C., Kulkarni, K., Zhang, Z., Kong, E. H., Barford, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+mitotic+checkpoint+complex.">Structure of the mitotic checkpoint complex.</a> Nature. 484 (7393), 208-213 (2012).</li><li>Yamada, K., Frouws, T. D., Angst, B., Fitzgerald, D. J., DeLuca, C., Schimmele, K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+the+chromatin+remodelling+factor+ISW1a.">Structure and mechanism of the chromatin remodelling factor ISW1a.</a> Nature. 472 (7344), 448-453 (2011).</li></ol>

Видео оснастку выстрелов на Фиг.2 и 3 иллюстрируют весь процесс от роботизированной поколения из кДНК мультигенное экспрессирующие конструкции, вплоть до заражения насекомыми культур клеток для продукции белка. Новые реагенты (плазмиды и вирусы) и надежные протоколы...

Биологическая активность контролируется сборки белков и других биомолекул, которые действуют совместно, чтобы катализировать клеточных функций. Известные примеры включают механизм, который расшифровывает наследственной информации, содержащейся в ДНК в РНК. У людей, более 100 белков собрались вместе в определенной и регулируемым процессом, чтобы расшифровать гены, образуя крупные комплексы мультибелковых с 10 и более субъединиц РНК-полимеразы в том числе II и общих факторов транскрипции, таких как TFIID, TFIIH и другие. 9 Другие примеры рибосомы, состоящие из многих белков и РНК, который катализирует синтез белка, или ядерного комплекса пор, который отвечает за челночные биомолекул посредством ядерной оболочки у эукариот. Подробные архитектурные и биохимические вскрытия практически всех многокомпонентных машин в клетке важно понять их функции. Выяснение структуры прокариотических и eukaryotic рибосомы, например, составили отличительной чертой событий получая беспрецедентное понимание, как эти машины макромолекулярными выполнять свои определенными функциями в клетке. 10,11 Рибосомы могут быть получены достаточные количества и качества для детального исследования путем очистки эндогенного материала из культивируемых клеток, в связи с тем, что до 30% от клеточной массы состоит из рибосом. РНК-полимераза II уже менее обильными на порядки, и многие тысячи литров дрожжевой культуры должны были быть обработаны для получения детальной атомной связи с этим необходимо, чтобы комплекс центральной транскрипции. 12 Подавляющее большинство других важных комплексов, однако в настоящее значительно ниже суммы в нативных клетках, и таким образом не может быть очищена от родных адекватно исходный материал. Оказывать такие комплексы доступными для детального структурного и функционального анализа требует гетерологичными производства с помощью рекомбинантных TEchniques. Рекомбинантного белка оказала большое влияние на жизни научных исследований. Многие белки были получены рекомбинантным, а их структура и функция расчлененный с высоким разрешением. Структурной геномики программ воспользовались выяснение геномы многих организмов для решения репертуаром генов произведения целых организмов в высокой пропускной способности (HT) режиме. Тысячи белковых структур таким образом, были определены. На сегодняшний день наиболее плодотворно использовать системы для производства рекомбинантных белков была E. палочка, и многие системы экспрессии были разработаны и уточнены в течение многих лет для гетерологичной производства в этой хоста. Плазмиды, несущие множество функциональных чтобы белка в E. палочка заполнить все каталоги коммерческих провайдеров. Тем не менее, E. палочка имеет определенные ограничения, которые делают его непригодным для производства многих эукариотических белков и в рсуставной белковые комплексы со многими субъединиц. Поэтому белка в эукариотических хозяев становится все более предпочтительным методом в последние годы. Особенно хорошо подходит система для получения эукариотических белков вектор экспрессии бакуловируса системы (BEVs), которая опирается на рекомбинантного бакуловируса проведение гетерологичных генов инфицировать насекомое клеточных культур выращивали в лаборатории. Система MultiBac является более недавно разработанных BEVs который особенно приспособлены для производства эукариотических белковые комплексы со многими субъединиц (рис. 1). MultiBac был впервые представлен в 2004 году. +13 С момента своего появления, MultiBac была постоянно совершенствуется и усовершенствованной для упрощения обработки, улучшения качества белка-мишени и в целом делает систему доступной для неспециалиста пользователей путем разработки эффективных стандартных операционных процедур (СОП). 4 MultiBac была реализована во многих лабораториях во всем мире, в соотademia и промышленности. На EMBL в Гренобле, транснациональных программах доступа были введены в действие Европейской комиссии обеспечить подготовку специалистов в MultiBac платформы для ученых, которые хотели бы использовать эту систему производства для продвижения своих исследований. Структура и функции многих белковых комплексов, которые были до сих пор не доступны было выяснено использованием образцов, полученных с MultiBac. 4 В дальнейшем основные этапы производства MultiBac сведены в протоколы, как в эксплуатацию в MultiBac объекта в EMBL Гренобле.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bluo-Gal</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15519-028 (1 g)</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tetracycline</td>
 <td>Euromedex</td>
 <td>UT2965-B (25 g)</td>
 <td>1,000X at 10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kanamycine</td>
 <td>Euromedex</td>
 <td>EU0420 (25 g)</td>
 <td>1,000X at 50 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gentamycine</td>
 <td>SIGMA</td>
 <td>G3632 (5 g)</td>
 <td>1,000X at 10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Euromedex</td>
 <td>EU0008-B (5 g)</td>
 <td>1,000X at 1M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cre-recombinase</td>
 <td>New England BioLabs</td>
 <td>M0298</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>X-Treme GENE HP transfection reagent</td>
 <td>Roche</td>
 <td>06 366 236 001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hyclone SFM4 Insect</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH 30913.02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-well plate Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>353046</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357507</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357543</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357551</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357535</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357550</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml tube Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>352070</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml tube Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>352096</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.8 ml cryotube Nunc</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>55005</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100 ml shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211917</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>250 ml shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211918</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>500 ml shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211919</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 L shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211921</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Certomat Orbital Shaker + plateau</td>
 <td>Sartorius</td>
 <td>4445110, 4445233</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Liquid nitrogen tank dewar 35 L</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>M76801</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biological Safety Cabinet Faster</td>
 <td>Sodipro</td>
 <td>FASV20000606</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical Microscope</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>451207</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sf21 Insect cells</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hi5 Insect cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>B855-02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tecan freedom EVO running Evoware plus</td>
 <td>TECAN</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 &mu;l conductive tips (black),</td>
 <td>TECAN</td>
 <td>10 612 516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>200 &mu;l conductive tips (black)</td>
 <td>TECAN</td>
 <td>10 612 510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>disposable trough for reagents, 100 ml</td>
 <td>TECAN</td>
 <td>10 613 049</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>twin.tec PCR plate 96, skirted</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>0030 128.648</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 well V bottom, non sterile</td>
 <td>BD falcon</td>
 <td>353263</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 deepwell plate color natural, PP)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>M3752M</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PS microplate, 96 well flat bottom</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>655101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 deepwell plate</td>
 <td>Thermo scientific</td>
 <td>AB-0932</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>24 well blocks RB</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>19583</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DpnI restriction enzyme</td>
 <td>NEB</td>
 <td>R0176L</td>
 <td>20 U/uL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NEBuffer 4 10X</td>
 <td>NEB</td>
 <td>B7004S</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2X phusion mastermix HF</td>
 <td>Finnzyme</td>
 <td>ref F-531L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2X phusion mastermix GC</td>
 <td>Finnzyme</td>
 <td>ref F-532L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DGLB 1.5X</td>
 <td>homemade</td>
 <td></td>
 <td>7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High DNA Mass Ladder for e-gel</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>10496-016</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low DNA Mass Ladder for e-gel</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>10068-013</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-gel 48 1% agarose GP</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>G8008-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit</td>
 <td>Macherey Nagel</td>
 <td>740 708.24</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract</td>
 <td>Macherey Nagel</td>
 <td>740 707.2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gotaq green master mix</td>
 <td>Promega</td>
 <td>M7113</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>T4 DNA polymerase, LIC-qualified</td>
 <td>Novagen</td>
 <td>70099-3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT 100 mM</td>
 <td>homemade</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Urea 2 M</td>
 <td>homemade</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA 500 mM pH 8.0</td>
 <td>Homemade</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LB broth (Miller) 500 g</td>
 <td>Athena ES</td>
 <td>103</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

the multibac protein complex production platform at the embl

Протеомики исследования показали впечатляющие сложности эукариотических протеомов в беспрецедентных деталях. Теперь это общепринятое понятие, что белков в клетках основном существуют не как изолированные сущности, но проявляют свою биологическую активность в сотрудничестве со многими другими белками, у человека десять и более, образуя сборочных линий в клетке для большинства, если не всех жизненно важных функций. 1 , 2 Знание функции и архитектура этих мультибелковых сборки требует их положение высшего качества и в достаточном количестве для детального анализа. Недостатком многих белковых комплексов в клетках, в частности у эукариот, запрещает их извлечения из природных источников, и требует рекомбинантной продукции. Вектор экспрессии бакуловируса системы (BEVs) оказалась особенно полезной для производства белков эукариот, деятельность которых зачастую зависит от посттрансляционное обработки, которые обычно используются другие системы экспрессии часто можетне поддерживают. 3 BEVs использовать рекомбинантный бакуловирус, в который ген был вставлен инфицировать насекомое клеточных культур, в свою очередь продуцировать белок выбора. MultiBac является BEVs, которая была разработана специально для производства эукариотических белковых комплексов, которые содержат множество субъединиц. 4 жизненно важным условием для эффективного производства белков и их комплексов являются надежными протоколов для всех операций, связанных выражение эксперимент, который идеально может быть реализован как стандартные операционные процедуры (СОП) и последуют и неспециалисту пользователей сравнительно легко. MultiBac платформы на Европейской лаборатории молекулярной биологии (EMBL) использует СОП для всех операций, связанных мультибелковый сложный эксперимент выражения, начиная с введения генов в геноме инженерных бакуловирусные оптимизирован для гетерологичными свойствами производства белка мелким анализа белка образцов, полученных. 5-8 платформыустановлен в открытом доступе в режиме EMBL Гренобля и поддержал многие ученые из академических и промышленных ускорить белковый комплекс исследовательских проектов.

Сильные совместной экспрессии гетерологичных белков достигается MultiBac система показана на рисунке 1d (зонды принято 48 часа после заражения суспензионной культуре клетки). Сверхэкспрессированную белковых полос явно видны во всем клеточном экстракте (SNP) и очищенного лизата (SN). ...

Watch this Scientific Journal Video about The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL at JoVE.com

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Белковые комплексы катализируют ключевые клеточные функции. Подробные функциональные и структурные характеристики многих важных комплексов требует рекомбинантного производства. MultiBac является бакуловирус / клетка насекомого разработана специально для выражения эукариотических белков и их комплексов. MultiBac был реализован как открытая платформа доступа, и стандартных оперативных процедур разработаны для максимального использования ее полезности.

MultiBac белкового комплекса добывающей платформы на EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Research

JoVE Journal

Biology

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

Валовой Препарирование Желудок Омар, Homarus атепсапиз</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Окрашивание белков в гелях Кумасси G-250 без органических растворителей и уксусной кислоты

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Использование GELFREE 8100 Фракционирование Система Молекулярный вес основе фракционирования с жидким этапе восстановления

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

Производство тканей Microarrays, иммуногистохимического окрашивания и цифровизации В правам Атлас белка

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Удобный и общее выражение платформы для производства секретируемых белков из клеток человека

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

Логика, экспериментальные шаги, и потенциал Гетерологичная природного биосинтеза продукта Благодаря комплекса антибиотик эритромицин производится через<em&gt; E. палочки</em

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities.  It is ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Культивирование носа человека эпителиальных клеток в Военно-воздушной жидкость

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Количественный иммунофлюоресценции для измерения различий в уровне белка на центросомах

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Зеленый флуоресцентный белок на основе Expression Скрининг мембранных белков в<em&gt; Кишечная палочка</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

CUBIC Протокол Визуализирует экспрессии белка в одной резолюции клетки в тотальных препаратах кожи Маунт

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...