Name: quantifying the mechanical properties of the endothelial glycocalyx with atomic force microscopy
Uploaded: 2013-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Elena Lomakina, Richard Bauserman, Margaret Youngman, Shay Vaknin, Jessica Snyder, Chris Striemer, Nakul Nataraj, Hung Li Chung, Tejas Khire, og Eric Lam for deres hjælp med dette projekt. Dette projekt blev finansieret af NIH # PA1 HL 018.208.

1. Metoder 1,1 Cell strømningskammeret En strømningskammeret, vist i figur 1, blev konstrueret således, at celler kan dyrkes under en forskydningshastighed på 1,0 Pa (10 dyn / cm 2) og derefter overført direkte til en Asyl MFP3D AFM (Santa Barbara, CA). <ol><li> Strømningskammeret blev forberedt til forsøget ved først at rense objektglas i Piranha-opløsning (3:01 H 2 SO 4: H 2 O 2) i ...

<ol>
	<li>Clifford, C., Seah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoindentation+measurement+of+young's+modulus+for+compliant+layers+on+stiffer+substrates+including+the+effect+of+poisson's+ratios.">Nanoindentation measurement of young's modulus for compliant layers on stiffer substrates including the effect of poisson's ratios.</a> Nanotechnology. , (2009).</li><li>Gouverneur, M., Spaan, J. A. E., Pannekoek, H., Fontijn, R. D., Vink, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+stimulates+incorporation+of+hyaluronan+into+endothelial+cell+glycocalyx.">Fluid shear stress stimulates incorporation of hyaluronan into endothelial cell glycocalyx.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 290 (1), 458-452 (2006).</li><li>Hocde, S. A., Hyrien, O., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecule+distribution+relative+to+neutrophil+surface+topography+assessed+by+tirfm.">Cell adhesion molecule distribution relative to neutrophil surface topography assessed by tirfm.</a> Biophysical Journal. 97 (1), 379-387 (2009).</li><li>Lipowski, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+glycocalyx+as+a+barrier+to+leukocyte+adhesion+and+its+mediation+by+extracellular+proteases.">The endothelial glycocalyx as a barrier to leukocyte adhesion and its mediation by extracellular proteases.</a> Annals of biomedical engineering. 40 (4), 840-848 (2012).</li><li>Lu, L., Oswald, S. J., Ngu, H., Yin, F. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+actin+stress+fibers+in+living+cells.">Mechanical properties of actin stress fibers in living cells.</a> Biophysical Journal. 95 (12), 6060-6071 (2008).</li><li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+surface+layer.">The endothelial surface layer.</a> Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 440 (5), 653-666 (2000).</li><li>Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesive+contact+dependence+on+impingement+force.">Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force.</a> Biophysical Journal. 87 (6), 4237-4245 (2004).</li><li>vanden Berg, B. M., Vink, H., Spaan, J. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+glycocalyx+protects+against+myocardial+edema.">The endothelial glycocalyx protects against myocardial edema.</a> Circulation Research. 92 (6), 592-594 (2003).</li><li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+impact+of+membrane+microtopology+on+effective+two-dimensional+affinity.">Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity.</a> J. Biol. Chem. 276 (16), 13283-138 (2001).</li><li>Vink, H., Duling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Distinct+Luminal+Domains+for+Macromolecules,+Erythrocytes,+and+Leukocytes+Within+Mammalian+Capillaries.">Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries.</a> Circulation Research. 79, 581-589 (1996).</li></ol>

Vi anvendte værdier beregnet ud fra de to-lags modellen og Hertz teori for at modellere interaktionen mellem en leukocyt cirkulerer i blodet med endotel væg. Vi har beregnet, at en microvillus på leukocyt med en diameter på 50 nm efter en 10 pN belastning ville led omkring 150 nm i glycocalyx, kun en brøkdel af den totale tykkelse. Dette indikerer, at glycocalyx, med egenskaber som målt ved dette forsøg, er en væsentlig hindring for celle-celle interaktion og kan være en stor sterisk hindring, som cellerne skal...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens / Material </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> McCoys medium </td><td> Gibco </td><td> 16600-082 </td><td></td></tr><tr><td> Føtalt kalveserum </td><td> Hyclone </td><td> SH30070 </td><td></td></tr><tr><td> Endotelcellevækst Medium </td><td> VEC Technologies </td><td> MCDB-131 </td><td></td></tr><tr><td> Pooled human navlevene endotelceller </td><td> VEC Technologies </td><td> PHUVEC/T-25 </td><td></td></tr><tr><td> Svovlsyre </td><td> JT Baker </td><td> 9681-02 </td><td></td></tr><tr><td> Hydrogenperoxid </td><td> VWR </td><td> BDH3742-1 </td><td></td></tr><tr><td> (3-aminopropyl) triethoxysilan </td><td> Aldrich </td><td> 440.140-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Isopropylalkohol </td><td> VWR </td><td> BDH8999-4 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Cellgro </td><td> 25-054-C1 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks Buffered Salt Solution </td><td> Gibco </td><td> 14175-095 </td><td></td></tr><tr><td> sulfo-NHS-LC-Biotin </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21.335 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavadin perler </td><td> Dynabeads </td><td> 112.06D </td><td></td></tr><tr><td> MFP-3D AFM </td><td> Asyl Research </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tipless Cantilevers </td><td> NanoWorld </td><td> Arrow-TL1-50 </td><td></td></tr><tr><td> Silhouette SD </td><td> Quickutz </td><td> Silhuet-SD </td><td></td></tr><tr><td> Siliconegummi </td><td> Stockwell elastomerer </td><td> SE50-RS </td><td></td></tr><tr><td> 30 ml sprøjter </td&gt; <td> Benton Dickinson </td><td> 309.650 </td><td></td></tr><tr><td> 18 gauge nåle </td><td> Benton Dickinson </td><td> 305.196 </td><td></td></tr><tr><td> Udvidelse Sets </td><td> Hospira </td><td> 4429-48 </td><td></td></tr><tr><td> 4 vejsventiler </td><td> Teleflex </td><td> W21372 </td><td></td></tr><tr><td> Mand / kvinde Port Caps </td><td> Smiths Medicinsk </td><td> MX491B </td><td></td></tr><tr><td> Peristaltisk pumpe </td><td> Watson-Marlow </td><td> 401U / D </td><td></td></tr><tr><td> Peristaltisk Tubing </td><td> Watson-Marlow </td><td> 903.0016.016 </td><td></td></tr><tr><td> sterile filtre </td><td> Pall Life Science </td><td> 4652 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantifying the mechanical properties of the endothelial glycocalyx with atomic force microscopy

Vores forståelse af samspillet af leukocytter og karvæggen under leukocyt capture er begrænset af en ufuldstændig forståelse af de mekaniske egenskaber af den endotele overfladelag. Det er kendt, at adhæsionsmolekyler på leukocytter er fordelt uensartet i forhold til overfladetopografi 3, at topografien begrænser klæbende bindingsdannelse med andre overflader 9, og at fysiologiske kontaktkræfter (≈ 5,0 til 10,0 pN pr microvillus) komprimerer mikrovilli som lidt som en tredjedel af de hviler længde, øge tilgængeligheden af molekyler til den modstående overflade 3, 7. Vi betragter endotel som en to-lags struktur, den relativt stive cellelegeme, plus glycocalyx, et blødt beskyttende sukkerovertræk på den luminale overflade 6. Det er blevet vist, at glycocalyx kan virke som en barriere til at reducere adhæsion af leukocytter til endoteloverfladen 4.I denne rapport har vi begynde at tage fat på deformerbarhed af endotheliale overflader for at forstå, hvordan den endotel mekaniske stivhed kan påvirke obligation formation. Endotelceller dyrket i statisk kultur ikke udtrykker en robust glycocalyx, men celler dyrket under fysiologiske flowbetingelser begynder at tilnærme glycocalyx observeret in vivo 2. Modulus for den endotelcelle organ er blevet målt under anvendelse atomic force mikroskopi (AFM) til ca 5 til 20 kPa 5. Tykkelsen og struktur glycocalyx er blevet undersøgt ved hjælp af elektronmikroskopi 8 og modulus for den glycocalyx er tilnærmet ved hjælp af indirekte metoder, men så vidt vides, har der ikke været offentliggjorte rapporter om en direkte måling af glycocalyx modul i levende celler . I denne undersøgelse præsenteres indrykning eksperimenter foretaget med en hidtil ukendt AFM probe på celler, der er dyrket under betingelser for at maksimere deres glycocalyx udtryk til make direkte målinger af modulet og tykkelsen af ​​endotel glycocalyx.

I et typisk eksperiment blev 20 kraft-vs-afstand kurver opnået fra en bestemt region af cellen, typisk i perinukleære region nær, men ikke på, kernen (inden for ~ 2 um). Kurverne blev tilpasset, så eventuel prøve drift under varigheden af målingen og derefter beregnet til fjernelse af cantilever støj, som vist i figur 4. Kurverne blev analyseret og passer med tolags model, der er udviklet til at bestemme modulus og tykkelsen af tynd polymer film 1. Fra anfald af kurverne i 25-celler, ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

De mekaniske egenskaber af endothelial glycocalyx blev målt ved indskæring ved hjælp mikronstørrelse kugler på AFM køreledningsophæng. Endotelceller blev dyrket i en brugerdefineret kammer under fysiologiske flow betingelser at inducere glycocalyx ekspression. Data analyseredes under anvendelse af en tynd film til bestemmelse af glycocalyx tykkelse og modulus.

Kvantificering af mekaniske egenskaber af de Endothelial glycocalyx med Atomic Force Microscopy

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Måling af mekaniske egenskaber af levende celler bruge Atomic Force Microscopy

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

En ny metode til lokalisering Reporter fluorescerende kugler nærheden cellekulturen overflade for trækkraft Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force mikroskopi Imaging og Kraft spektroskopi af understøttede lipiddobbeltlag

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

In Situ Kortlægning af de mekaniske egenskaber af biofilm fra Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Syntese af Hydrogeler med antitilsmudsningsegenskaber som membraner til vandrensning

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

En Millimeter skala bøjnings test System til måling af de mekaniske egenskaber af Marine svamp knoglesplinter

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Biaksiale mekaniske beskrivelser af atrioventrikulær hjerteklapper

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Anvendelse af Atomic Force Mikroskopi til at opdage tidlig slidgigt

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...