Name: quantifying the mechanical properties of the endothelial glycocalyx with atomic force microscopy
Uploaded: 2013-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy at JoVE.com

De auteurs willen graag Elena Lomakina, Richard Bauserman, Margaret Youngman, Shay Vaknin, Jessica Snyder, Chris Striemer, Nakul Nataraj, Hung Li Chung, Tejas Khire, en Eric Lam bedanken voor hun hulp bij dit project. Dit project werd gefinancierd door NIH # PO1 HL 018208.

1. Methoden 1,1 Cell Flow Kamer Een stromingskamer, getoond in figuur 1, is geconstrueerd dat cellen kunnen worden gekweekt onder een afschuifsnelheid van 1,0 Pa (10 dyn / cm 2) en vervolgens direct overgebracht naar een Asylum MFP3D AFM (Santa Barbara, CA). <ol><li> De stromingskamer werd voorbereid voor de proef door eerst reinigen van de glaasjes in Piranha-oplossing (3:1 H 2 SO 4: H 2 O 2)...

<ol>
	<li>Clifford, C., Seah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoindentation+measurement+of+young's+modulus+for+compliant+layers+on+stiffer+substrates+including+the+effect+of+poisson's+ratios.">Nanoindentation measurement of young's modulus for compliant layers on stiffer substrates including the effect of poisson's ratios.</a> Nanotechnology. , (2009).</li><li>Gouverneur, M., Spaan, J. A. E., Pannekoek, H., Fontijn, R. D., Vink, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+stimulates+incorporation+of+hyaluronan+into+endothelial+cell+glycocalyx.">Fluid shear stress stimulates incorporation of hyaluronan into endothelial cell glycocalyx.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 290 (1), 458-452 (2006).</li><li>Hocde, S. A., Hyrien, O., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecule+distribution+relative+to+neutrophil+surface+topography+assessed+by+tirfm.">Cell adhesion molecule distribution relative to neutrophil surface topography assessed by tirfm.</a> Biophysical Journal. 97 (1), 379-387 (2009).</li><li>Lipowski, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+glycocalyx+as+a+barrier+to+leukocyte+adhesion+and+its+mediation+by+extracellular+proteases.">The endothelial glycocalyx as a barrier to leukocyte adhesion and its mediation by extracellular proteases.</a> Annals of biomedical engineering. 40 (4), 840-848 (2012).</li><li>Lu, L., Oswald, S. J., Ngu, H., Yin, F. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+actin+stress+fibers+in+living+cells.">Mechanical properties of actin stress fibers in living cells.</a> Biophysical Journal. 95 (12), 6060-6071 (2008).</li><li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+surface+layer.">The endothelial surface layer.</a> Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 440 (5), 653-666 (2000).</li><li>Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesive+contact+dependence+on+impingement+force.">Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force.</a> Biophysical Journal. 87 (6), 4237-4245 (2004).</li><li>vanden Berg, B. M., Vink, H., Spaan, J. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+glycocalyx+protects+against+myocardial+edema.">The endothelial glycocalyx protects against myocardial edema.</a> Circulation Research. 92 (6), 592-594 (2003).</li><li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+impact+of+membrane+microtopology+on+effective+two-dimensional+affinity.">Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity.</a> J. Biol. Chem. 276 (16), 13283-138 (2001).</li><li>Vink, H., Duling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Distinct+Luminal+Domains+for+Macromolecules,+Erythrocytes,+and+Leukocytes+Within+Mammalian+Capillaries.">Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries.</a> Circulation Research. 79, 581-589 (1996).</li></ol>

We gebruikten waarden berekend uit de tweelagige model en Hertz theorie de interactie van leukocyten in het bloed aan de endotheel wand model. We hebben berekend dat een microvillus de leukocyten met een diameter van 50 nm minder dan 10 pN belasting zou ongeveer 150 nm streepje, in de glycocalyx, slechts een fractie van de totale dikte. Dit betekent dat de glycocalyx, met eigenschappen zoals gemeten in dit experiment, is een belangrijke belemmering voor cel-cel interactie en kan een grote sterische hindering die de cell...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Materiaal </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> McCoy&#39;s Medium </td><td> Gibco </td><td> 16600-082 </td><td></td></tr><tr><td> Foetaal kalfsserum </td><td> Hyclone </td><td> SH30070 </td><td></td></tr><tr><td> Endotheelcelgroei Medium </td><td> Vec Technologies </td><td> MCDB-131 </td><td></td></tr><tr><td> Gepoolde Human Umbilical Vein Endothelial Cells </td><td> Vec Technologies </td><td> PHUVEC/T-25 </td><td></td></tr><tr><td> Zwavelzuur </td><td> JT Baker </td><td> 9681-02 </td><td></td></tr><tr><td> Waterstofperoxide </td><td> VWR </td><td> BDH3742-1 </td><td></td></tr><tr><td> (3-aminopropyl) triethoxysilaan </td><td> Aldrich </td><td> 440140-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Isopropylalcohol </td><td> VWR </td><td> BDH8999-4 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine </td><td> Cellgro </td><td> 25-054-C1 </td><td></td></tr><tr><td> Gebufferde zoutoplossing Hank&#39;s oplossing </td><td> Gibco </td><td> 14175-095 </td><td></td></tr><tr><td> sulfo-NHS-LC-Biotin </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21335 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavadin kralen </td><td> Dynabeads </td><td> 112.06D </td><td></td></tr><tr><td> MFP-3D AFM </td><td> Asiel Research </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tipless uitkragingen </td><td> Nanowereld </td><td> PIJL-TL1-50 </td><td></td></tr><tr><td> Silhouette SD </td><td> Quickutz </td><td> Silhouet-SD </td><td></td></tr><tr><td> Silicone Rubber </td><td> Stockwell elastomeren </td><td> SE50-RS </td><td></td></tr><tr><td> 30 ml spuiten </td&gt; <td> Benton Dickinson </td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> 18 gauge naalden </td><td> Benton Dickinson </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> Extensiesets </td><td> Hospira </td><td> 4429-48 </td><td></td></tr><tr><td> 4-weg kleppen </td><td> Teleflex </td><td> W21372 </td><td></td></tr><tr><td> Man / Vrouw Port Petten </td><td> Smith&#39;s Medical </td><td> MX491B </td><td></td></tr><tr><td> Peristaltische Pomp </td><td> Watson-Marlow </td><td> 401U / D </td><td></td></tr><tr><td> Peristaltische Tubing </td><td> Watson-Marlow </td><td> 903.0016.016 </td><td></td></tr><tr><td> steriele filters </td><td> Pall Life Science </td><td> 4652 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantifying the mechanical properties of the endothelial glycocalyx with atomic force microscopy

Ons begrip van de interactie van leukocyten en de vaatwand tijdens leukocyt capture wordt beperkt door een onvolledig begrip van de mechanische eigenschappen van het endotheeloppervlak laag. Het is bekend dat adhesiemoleculen op leukocyten zijn niet gelijkmatig ten opzichte oppervlaktopografie 3 verdeeld, dat topografie beperkt lijmverbinding formatie met andere oppervlakken 9, en fysiologische contactkrachten (≈ 5,0 tot 10,0 per microvillus pN) kan de microvilli comprimeren als slechts een derde van hun lengte rusten, de toegankelijkheid van moleculen aan het tegenoverliggende oppervlak 3, 7. We beschouwen het endotheel als een twee-lagen structuur, de betrekkelijk stijve cellichaam, plus de glycocalyx, een zachte beschermende suiker coating op het luminale oppervlak 6. Het is aangetoond dat de glycocalyx kan fungeren als een barrière om de hechting van leukocyten verminderen aan het endotheliale oppervlak 4.In dit rapport hebben we beginnen met de vervormbaarheid van endotheliale oppervlakken aan te pakken om te begrijpen hoe de endotheliale mechanische stijfheid kunnen bindingsvorming beïnvloeden. Endotheliale cellen gekweekt in statische cultuur spreken zich niet uit robuust glycocalyx, maar cellen gekweekt onder fysiologische stromingscondities beginnen een benadering van de glycocalyx waargenomen in vivo 2. De modulus van de endotheelcellen lichaam is gemeten met behulp van atomic force microscopie (AFM) om ongeveer 5 tot 20 kPa 5. De dikte en structuur van de glycocalyx werden bestudeerd met elektronenmicroscopie 8 en de modulus van de glycocalyx is benaderd door indirecte methoden, maar voor zover wij weten, zijn er geen gepubliceerde verslagen van een directe meting van de glycocalyx modulus in levende cellen . In deze studie presenteren we inkeping proeven met een nieuwe AFM probe op cellen die zijn gekweekt in omstandigheden hun glycocalyx expressie maximaliseren make directe metingen van de modulus en de dikte van de endotheliale glycocalyx.

In een typisch experiment werden 20 kracht-vs-afstand curves verkregen uit een bepaald gebied van de cel, meestal in de perinucleaire regio dichtbij, maar niet op de kern (binnen ~ 2 pm). De krommen werden aangepast om eventuele drift monster gedurende de duur van de meting en vervolgens gemiddeld om cantilever ruis, zoals getoond in figuur 4. De curven werden geanalyseerd en passen de twee lagen model dat is ontwikkeld voor het bepalen van de modulus en de dikte van dunne polymeerfilms 1. Ui...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

De mechanische eigenschappen van endotheliale glycocalyx gemeten door inkeping met micron bollen op AFM uitkragingen. Endotheelcellen werden gekweekt in een aangepaste kamer onder fysiologische voorwaarden stroom glycocalyx expressie te induceren. De gegevens werden geanalyseerd met een dunne film model de glycocalyx dikte en modulus te bepalen.

Het kwantificeren van de mechanische eigenschappen van de Endotheliale Kalende haarvaten met Atomic Force Microscopy

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

Bacteriële Immobilisatie for Imaging door Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Visualisatie van Recombinant DNA en eiwit complexen met behulp van Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Het meten van de mechanische eigenschappen van levende cellen door gebruik Atomic Force Microscopy

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Een nieuwe methode voor het lokaliseren van Reporter Fluorescent Beads Dichtbij de celkweek Surface voor Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic Force Microscopy Imaging en Force Spectroscopie van Ondersteunde lipidendubbellagen

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

In Situ Mapping van de mechanische eigenschappen van Biofilms per Particle volgen Microreologie

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Synthese van Hydrogels met Antifouling eigenschappen membranen voor waterzuivering

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

Een Millimeter schaal buigsterkte testsysteem voor het meten van de mechanische eigenschappen van mariene spons botsplinters

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Biaxial mechanische karakteristieken van Atrioventriculaire hartkleppen

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Toepassing van Atomic Force Microscopie om vroege artrose op te sporen

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...