Name: quantifying the mechanical properties of the endothelial glycocalyx with atomic force microscopy
Uploaded: 2013-02-21T13:00:00
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Les auteurs tiennent à remercier Elena Lomakina, Richard Bauserman, Margaret Youngman, Shay Vaknin, Jessica Snyder, Chris Striemer, Nakul Nataraj, Hung Li Chung, Tejas Khire, et Eric Lam pour leur aide dans ce projet. Ce projet a été financé par le NIH # 018208 PO1 HL.

1. Méthodes 1.1 Chambre débit cellulaire Une chambre d&#39;écoulement, illustré à la figure 1, a été construit de telle sorte que les cellules peuvent être cultivées sous un cisaillement de 1,0 Pa (10 dynes / cm 2), puis transféré directement à un asile MFP3D AFM (Santa Barbara, CA). <ol><li> La chambre de circulation a été préparé pour l&#39;expérience d&#39;abord nettoyer les lames de verre dans une solution piranha (...

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	<li>Clifford, C., Seah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoindentation+measurement+of+young's+modulus+for+compliant+layers+on+stiffer+substrates+including+the+effect+of+poisson's+ratios.">Nanoindentation measurement of young's modulus for compliant layers on stiffer substrates including the effect of poisson's ratios.</a> Nanotechnology. , (2009).</li><li>Gouverneur, M., Spaan, J. A. E., Pannekoek, H., Fontijn, R. D., Vink, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+stimulates+incorporation+of+hyaluronan+into+endothelial+cell+glycocalyx.">Fluid shear stress stimulates incorporation of hyaluronan into endothelial cell glycocalyx.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 290 (1), 458-452 (2006).</li><li>Hocde, S. A., Hyrien, O., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecule+distribution+relative+to+neutrophil+surface+topography+assessed+by+tirfm.">Cell adhesion molecule distribution relative to neutrophil surface topography assessed by tirfm.</a> Biophysical Journal. 97 (1), 379-387 (2009).</li><li>Lipowski, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+glycocalyx+as+a+barrier+to+leukocyte+adhesion+and+its+mediation+by+extracellular+proteases.">The endothelial glycocalyx as a barrier to leukocyte adhesion and its mediation by extracellular proteases.</a> Annals of biomedical engineering. 40 (4), 840-848 (2012).</li><li>Lu, L., Oswald, S. J., Ngu, H., Yin, F. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+actin+stress+fibers+in+living+cells.">Mechanical properties of actin stress fibers in living cells.</a> Biophysical Journal. 95 (12), 6060-6071 (2008).</li><li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+surface+layer.">The endothelial surface layer.</a> Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 440 (5), 653-666 (2000).</li><li>Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesive+contact+dependence+on+impingement+force.">Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force.</a> Biophysical Journal. 87 (6), 4237-4245 (2004).</li><li>vanden Berg, B. M., Vink, H., Spaan, J. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+glycocalyx+protects+against+myocardial+edema.">The endothelial glycocalyx protects against myocardial edema.</a> Circulation Research. 92 (6), 592-594 (2003).</li><li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+impact+of+membrane+microtopology+on+effective+two-dimensional+affinity.">Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity.</a> J. Biol. Chem. 276 (16), 13283-138 (2001).</li><li>Vink, H., Duling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Distinct+Luminal+Domains+for+Macromolecules,+Erythrocytes,+and+Leukocytes+Within+Mammalian+Capillaries.">Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries.</a> Circulation Research. 79, 581-589 (1996).</li></ol>

Nous avons utilisé les valeurs calculées à partir du modèle à deux couches et la théorie de Hertz pour modéliser l&#39;interaction d&#39;un leucocyte circulant dans le sang avec la paroi endothéliale. Nous avons calculé qu&#39;une microvillosités sur les leucocytes d&#39;un diamètre de 50 nm sous une charge de 10 pN aurait tiret environ 150 nm dans le glycocalyx, seule une fraction de l&#39;épaisseur totale. Ceci indique que le glycocalyx, avec des propriétés telles que mesurées dans cette expérience, es...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> McCoy moyen </td><td> Gibco </td><td> 16600-082 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau foetal </td><td> Hyclone </td><td> SH30070 </td><td></td></tr><tr><td> Endothelial Cell Growth Medium </td><td> Technologies Vec </td><td> MCDB-131 </td><td></td></tr><tr><td> Communs cellules humaines endothéliales de veine ombilicale </td><td> Technologies Vec </td><td> PHUVEC/T-25 </td><td></td></tr><tr><td> Acide sulfurique </td><td> JT Baker </td><td> 9681-02 </td><td></td></tr><tr><td> Peroxyde d&#39;hydrogène </td><td> VWR </td><td> BDH3742-1 </td><td></td></tr><tr><td> (3-aminopropyl) triéthoxysilane </td><td> Aldrich </td><td> 440140-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Alcool isopropylique </td><td> VWR </td><td> BDH8999-4 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine </td><td> Cellgro </td><td> 25-054 C1- </td><td></td></tr><tr><td> Hank solution saline tamponnée </td><td> Gibco </td><td> 14175-095 </td><td></td></tr><tr><td> sulfo-NHS-LC-biotine </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21335 </td><td></td></tr><tr><td> Perles Streptavadin </td><td> Dynabeads </td><td> 112.06D </td><td></td></tr><tr><td> MFP-3D AFM </td><td> Asylum Research </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cantilevers sans pointe </td><td> Nanomonde </td><td> ARROW-TL1-50 </td><td></td></tr><tr><td> Silhouette SD </td><td> Quickutz </td><td> Silhouette-SD </td><td></td></tr><tr><td> Le caoutchouc de silicone </td><td> Stockwell Elastomerics </td><td> SE50-RS </td><td></td></tr><tr><td> 30 seringues ml </td&gt; <td> Benton Dickinson </td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> 18 aiguilles de calibre </td><td> Benton Dickinson </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> Prolongateurs </td><td> Hospira </td><td> 4429-48 </td><td></td></tr><tr><td> Vannes 4 voies </td><td> Teleflex </td><td> W21372 </td><td></td></tr><tr><td> Casquettes Port Mâle / Femelle </td><td> Smith médicale </td><td> MX491B </td><td></td></tr><tr><td> Pompe péristaltique </td><td> Watson-Marlow </td><td> 401U / D </td><td></td></tr><tr><td> Tuyau péristaltique </td><td> Watson-Marlow </td><td> 903.0016.016 </td><td></td></tr><tr><td> filtres stériles </td><td> Pall Life Science </td><td> 4652 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantifying the mechanical properties of the endothelial glycocalyx with atomic force microscopy

Notre compréhension de l&#39;interaction des leucocytes et la paroi de la cuve lors de la capture des leucocytes est limitée par une compréhension incomplète des propriétés mécaniques de la couche de surface endothéliale. Il est connu que les molécules d&#39;adhésion sur les leucocytes sont répartis non uniformément par rapport à la topographie de surface 3, que la topographie limite la formation de liaison adhésive avec d&#39;autres surfaces 9, et que les forces de contact physiologiques (≈ 5,0 à 10,0 pN par microvillosités) permet de compresser les microvillosités comme moins un tiers de leur longueur au repos, ce qui augmente l&#39;accessibilité des molécules à la surface opposée 3, 7. On considère que l&#39;endothélium d&#39;une structure à deux couches, le corps de cellule relativement rigide, plus la glycocalyx, un enrobage de sucre souple de protection sur la surface luminale 6. Il a été démontré que le glycocalyx peut agir comme une barrière pour réduire l&#39;adhérence des leucocytes à l&#39;endothélium 4 Surface.Dans ce rapport, nous commençons à aborder la déformabilité des surfaces endothéliales de comprendre comment la rigidité mécanique endothéliale pourrait affecter la formation de liaisons. Les cellules endothéliales en culture statique n&#39;expriment pas un glycocalyx robuste, mais les cellules cultivées dans des conditions d&#39;écoulement physiologiques commencent à approcher le glycocalyx observée in vivo 2. Le module de l&#39;organisme des cellules endothéliales a été mesurée par microscopie à force atomique (AFM) à environ 5 à 20 kPa 5. L&#39;épaisseur et la structure du glycocalyx ont été étudiés en microscopie électronique à 8, et le module du glycocalyx a été estimés à l&#39;aide des méthodes indirectes, mais à notre connaissance, il n&#39;y a pas eu de rapports publiés par une mesure directe du module glycocalyx des cellules vivantes . Dans cette étude, nous présentons des expériences faites avec indentation une nouvelle sonde AFM sur des cellules qui ont été cultivées dans des conditions de maximiser leur expression glycocalyx à mamesures directes de la ke module et de l&#39;épaisseur de la glycocalyx endothéliale.

Dans une expérience typique, 20 force vs distance courbes ont été obtenues à partir d&#39;une région donnée de la cellule, généralement dans la région périnucléaire, à proximité, mais pas sur le noyau (dans ~ 2 um). Les courbes ont été alignés pour tenir compte de toute dérive échantillon au cours de la durée de la mesure, puis la moyenne pour éliminer le bruit en porte à faux, comme le montre la figure 4. Les courbes ont été analysés et qui cadrent avec le modèle à deux couche...

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Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Les caractéristiques mécaniques du glycocalyx endothéliale ont été mesurées par indentation à l&#39;aide des sphères micrométriques sur des cantilevers AFM. Les cellules endothéliales ont été cultivées dans une chambre de mesure dans des conditions physiologiques de flux pour induire l&#39;expression glycocalyx. Les données ont été analysées en utilisant un modèle de film mince pour déterminer l&#39;épaisseur et le module glycocalyx.

Quantification des propriétés mécaniques de la Glycocalyx endothéliale par microscopie à force atomique

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Immobilisation bactérienne pour l&#39;imagerie par microscopie à force atomique

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Recherche

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Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

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