Name: quantifying the mechanical properties of the endothelial glycocalyx with atomic force microscopy
Uploaded: 2013-02-21T13:00:00
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Die Autoren bedanken sich bei Elena Lomakina, Richard Bauserman, Margaret Youngman, Shay Vaknin, Jessica Snyder, Chris Striemer, Nakul Nataraj, Hung Li Chung, Tejas Khire und Eric Lam für ihre Unterstützung bei diesem Projekt danken. Dieses Projekt wurde durch die NIH # PO1 HL 018208 finanziert.

Ein. Methoden 1,1 Zelle Flusskammer Ein Strömungskammer, in Abbildung 1 dargestellt, wurde so konstruiert, dass Zellen unter einer Scherung von 1,0 Pa (10 dyn / cm 2) angebaut werden könnten und dann direkt mit einer Asylum MFP3D AFM (Santa Barbara, CA) transferiert. <ol><li> Für 15 min und dann Waschen mit destilliertem Wasser: Die Strömungskammer wurde für den Versuch durch erste Reinigung der Glasträger in Piranhalösung (H <su...

<ol>
	<li>Clifford, C., Seah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoindentation+measurement+of+young's+modulus+for+compliant+layers+on+stiffer+substrates+including+the+effect+of+poisson's+ratios.">Nanoindentation measurement of young's modulus for compliant layers on stiffer substrates including the effect of poisson's ratios.</a> Nanotechnology. , (2009).</li><li>Gouverneur, M., Spaan, J. A. E., Pannekoek, H., Fontijn, R. D., Vink, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+stimulates+incorporation+of+hyaluronan+into+endothelial+cell+glycocalyx.">Fluid shear stress stimulates incorporation of hyaluronan into endothelial cell glycocalyx.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 290 (1), 458-452 (2006).</li><li>Hocde, S. A., Hyrien, O., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecule+distribution+relative+to+neutrophil+surface+topography+assessed+by+tirfm.">Cell adhesion molecule distribution relative to neutrophil surface topography assessed by tirfm.</a> Biophysical Journal. 97 (1), 379-387 (2009).</li><li>Lipowski, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+glycocalyx+as+a+barrier+to+leukocyte+adhesion+and+its+mediation+by+extracellular+proteases.">The endothelial glycocalyx as a barrier to leukocyte adhesion and its mediation by extracellular proteases.</a> Annals of biomedical engineering. 40 (4), 840-848 (2012).</li><li>Lu, L., Oswald, S. J., Ngu, H., Yin, F. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+actin+stress+fibers+in+living+cells.">Mechanical properties of actin stress fibers in living cells.</a> Biophysical Journal. 95 (12), 6060-6071 (2008).</li><li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+surface+layer.">The endothelial surface layer.</a> Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 440 (5), 653-666 (2000).</li><li>Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesive+contact+dependence+on+impingement+force.">Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force.</a> Biophysical Journal. 87 (6), 4237-4245 (2004).</li><li>vanden Berg, B. M., Vink, H., Spaan, J. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+glycocalyx+protects+against+myocardial+edema.">The endothelial glycocalyx protects against myocardial edema.</a> Circulation Research. 92 (6), 592-594 (2003).</li><li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+impact+of+membrane+microtopology+on+effective+two-dimensional+affinity.">Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity.</a> J. Biol. Chem. 276 (16), 13283-138 (2001).</li><li>Vink, H., Duling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Distinct+Luminal+Domains+for+Macromolecules,+Erythrocytes,+and+Leukocytes+Within+Mammalian+Capillaries.">Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries.</a> Circulation Research. 79, 581-589 (1996).</li></ol>

Wir verwendeten Werte aus dem Zwei-Schichten-Modells und Hertz Theorie, um die Wechselwirkung eines Leukozyten im Blut zirkulierenden Endothelzellen mit der Wand Modell berechnet. Wir haben errechnet, daß eine auf der Mikrovillus Leukozyten mit einem Durchmesser von 50 nm unter einer 10 pN Last würde Gedankenstrich etwa 150 nm in die Glykocalix, nur einen Bruchteil der Gesamtdicke. Dies zeigt an, dass der Glykocalix, mit Eigenschaften wie in diesem Experiment gemessen, eine erhebliche Barriere für Zell-Zell-Wechselwi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> McCoy-Medium </td><td> Gibco </td><td> 16600-082 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Calf Serum </td><td> Hyclone </td><td> SH30070 </td><td></td></tr><tr><td> Endothelial Cell Growth Medium </td><td> Vec Technologies </td><td> MCDB-131 </td><td></td></tr><tr><td> Gepoolten menschlichen Nabelschnur-Endothelzellen </td><td> Vec Technologies </td><td> PHUVEC/T-25 </td><td></td></tr><tr><td> Schwefelsäure </td><td> JT Baker </td><td> 9681-02 </td><td></td></tr><tr><td> Wasserstoffperoxid </td><td> VWR </td><td> BDH3742-1 </td><td></td></tr><tr><td> (3-Aminopropyl) triethoxysilan </td><td> Aldrich </td><td> 440.140-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Isopropylalkohol </td><td> VWR </td><td> BDH8999-4 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Cellgro </td><td> 25-054-C1 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks Buffered Salt Solution </td><td> Gibco </td><td> 14175-095 </td><td></td></tr><tr><td> Sulfo-NHS-LC-Biotin </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21335 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavadin Perlen </td><td> Dynabeads </td><td> 112.06D </td><td></td></tr><tr><td> MFP-3D AFM </td><td> Asylum Research </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Spitzenlose Cantilevers </td><td> Nanowelt </td><td> ARROW-TL1-50 </td><td></td></tr><tr><td> Silhouette SD </td><td> Quickutz </td><td> Silhouette-SD </td><td></td></tr><tr><td> Silicone Rubber </td><td> Stockwell Elastomerics </td><td> SE50-RS </td><td></td></tr><tr><td> 30 ml Spritzen </td&gt; <td> Benton Dickinson </td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> 18 Gauge-Nadeln </td><td> Benton Dickinson </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> Erweiterung Sets </td><td> Hospira </td><td> 4429-48 </td><td></td></tr><tr><td> 4-Wege-Ventile </td><td> Teleflex </td><td> W21372 </td><td></td></tr><tr><td> Male / Female Hafen Caps </td><td> Smiths Medical </td><td> MX491B </td><td></td></tr><tr><td> Schlauchpumpen </td><td> Watson-Marlow </td><td> 401U / D </td><td></td></tr><tr><td> Schlauchpumpen Tubing </td><td> Watson-Marlow </td><td> 903.0016.016 </td><td></td></tr><tr><td> Sterilfilter </td><td> Pall Life Science </td><td> 4652 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantifying the mechanical properties of the endothelial glycocalyx with atomic force microscopy

Unser Verständnis der Wechselwirkung von Leukozyten und der Gefäßwand während Leukozyten-Abscheidung wird durch eine unvollständige Verständnis der mechanischen Eigenschaften des endothelialen Oberflächenschicht begrenzt. Es ist bekannt, dass Adhäsionsmolekülen auf Leukozyten ungleichmäßig relativ Oberflächentopographie 3 verteilt, begrenzt, dass Topographie Klebeverbindung Formation mit anderen Oberflächen 9, und dass physiologische Anpresskräfte (≈ 5,0 bis 10,0 pN pro Mikrovillus) können die Mikrovilli als komprimieren weniger als ein Drittel ihrer Ruhelänge, Erhöhung der Zugänglichkeit von Molekülen an die Gegenfläche 3, 7. Wir betrachten das Endothel als Zwei-Schichtstruktur, der relativ starren Zellkörper, plus der Glykocalix, eine weiche Schutzschicht Zuckerdragierung auf der luminalen Oberfläche 6. Es hat sich gezeigt, dass die Glykocalix kann als eine Barriere, um die Adhäsion von Leukozyten an das Endothel Oberfläche 4 zu reduzieren handeln.In diesem Bericht werden wir damit beginnen, die Verformbarkeit der endothelialen Oberflächen behandeln zu verstehen, wie die endotheliale mechanische Steifigkeit könnte Bindung beeinflussen. Endothelzellen in statischer Kultur gezüchtet nicht Ausdruck eines robusten Glykokalyx, aber Zellen unter physiologischen Strömungsverhältnisse gewachsen beginnen ungefähre dem Glykokalyx in vivo 2 beobachtet. Der Modul der Endothelzelle Körpers gemessen wurde mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) auf etwa 5 bis 20 kPa 5 sein. Die Dicke und Struktur der Glykocalix wurden mittels Elektronenmikroskopie untersucht 8, und der Modulus der Glykocalix wurde approximiert durch indirekte Methoden, aber nach unserem Wissen gibt es keine veröffentlichten Berichten einer direkten Messung der Glykocalix Modulus in lebenden Zellen . In dieser Studie zeigen wir Experimente Einbuchtung mit einem neuartigen AFM-Sonde auf Zellen, die unter Bedingungen kultiviert wurden, um ihre Expression zu ma Glycocalyx zu maximierenke direkte Messungen der Elastizitätsmodul und die Dicke des endothelialen Glykocalix.

In einem typischen Experiment wurden 20 Kraft-gegen-Entfernungskurven aus einem gegebenen Bereich der Zelle erhalten wird, typischerweise in der perinukleären Region, in der Nähe, aber nicht auf, den Kern (innerhalb ~ 2 um). Die Kurven wurden zur Berücksichtigung eines Probe Drift über die Dauer der Messung ausgerichtet und dann gemittelt, um Geräusche zu entfernen Cantilever, wie in Abbildung 4 dargestellt. Die Kurven wurden analysiert und passen mit den zwei Schichten-Modell, das zur Bestimmung d...

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Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Die mechanischen Eigenschaften von Endothelzellen Glykokalyx wurden durch Einrückung mit Mikrometer große Kugeln auf AFM Cantilever gemessen. Endothelzellen wurden in einem benutzerdefinierten Kammer unter physiologischen Bedingungen kultiviert, um die Strömung Glykocalix Expression zu induzieren. Daten wurden unter Verwendung eines Dünnfilm-Modell, um die Dicke und Elastizitätsmodul Glykocalix bestimmen.

Die Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften des Endothelial Glykokalyx mit Atomic Force Microscopy

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

Bakterielle Immobilisierung für Imaging von Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Forschung

Biotechnik

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Visualisierung von rekombinanten DNA-und Protein-Komplexe mit Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Eine neue Methode zur Lokalisierung Reporter fluoreszierende Kügelchen In der Nähe der Zellkulturoberfläche für Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Rasterkraftmikroskopie und Imaging Kraftspektroskopie von unterstützten Lipiddoppelschichten

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

In-situ-Mapping der mechanischen Eigenschaften von Biofilmen durch Partikel-Tracking Mikrorheologie

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Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Synthese von Hydrogelen mit Antifouling-Eigenschaften als Membranen für die Wasserreinigung

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

Ein Millimeter Skala Biege-Prüfsystem zur Messung der mechanischen Eigenschaften von marinen Schwamm Knochensplitter

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Biaxiale mechanische Charakterisierung von ventrikulären Herzklappen

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Anwendung der Atomkraftmikroskopie zur Erkennung früher Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...