Name: quantifying the mechanical properties of the endothelial glycocalyx with atomic force microscopy
Uploaded: 2013-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Elena Lomakina, Richard Bauserman, Margaret Youngman, Shay Vaknin, Jessica Snyder, Chris Striemer, Nakul Nataraj, Hung Li Chung, Tejas Khire og Eric Lam for deres hjelp med dette prosjektet. Dette prosjektet ble finansiert av NIH # PO1 HL 018208.

1. Metoder 1.1 Cell Flow Chamber En vannstrøms kammer, vist i figur 1, ble konstruert slik at celler kan dyrkes under en skjærkraft på 1,0 Pa (10 dyn / cm 2), og deretter overføres direkte til et asyl MFP3D AFM (Santa Barbara, CA). <ol><li> Flyten kammeret ble utarbeidet for forsøket ved først å rense glassplater i piranha løsning (3:1 H 2 SO 4: H 2 O 2) i 15 minutter og deretter vaske...

<ol>
	<li>Clifford, C., Seah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoindentation+measurement+of+young's+modulus+for+compliant+layers+on+stiffer+substrates+including+the+effect+of+poisson's+ratios.">Nanoindentation measurement of young's modulus for compliant layers on stiffer substrates including the effect of poisson's ratios.</a> Nanotechnology. , (2009).</li><li>Gouverneur, M., Spaan, J. A. E., Pannekoek, H., Fontijn, R. D., Vink, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+stimulates+incorporation+of+hyaluronan+into+endothelial+cell+glycocalyx.">Fluid shear stress stimulates incorporation of hyaluronan into endothelial cell glycocalyx.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 290 (1), 458-452 (2006).</li><li>Hocde, S. A., Hyrien, O., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecule+distribution+relative+to+neutrophil+surface+topography+assessed+by+tirfm.">Cell adhesion molecule distribution relative to neutrophil surface topography assessed by tirfm.</a> Biophysical Journal. 97 (1), 379-387 (2009).</li><li>Lipowski, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+glycocalyx+as+a+barrier+to+leukocyte+adhesion+and+its+mediation+by+extracellular+proteases.">The endothelial glycocalyx as a barrier to leukocyte adhesion and its mediation by extracellular proteases.</a> Annals of biomedical engineering. 40 (4), 840-848 (2012).</li><li>Lu, L., Oswald, S. J., Ngu, H., Yin, F. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+actin+stress+fibers+in+living+cells.">Mechanical properties of actin stress fibers in living cells.</a> Biophysical Journal. 95 (12), 6060-6071 (2008).</li><li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+surface+layer.">The endothelial surface layer.</a> Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 440 (5), 653-666 (2000).</li><li>Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesive+contact+dependence+on+impingement+force.">Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force.</a> Biophysical Journal. 87 (6), 4237-4245 (2004).</li><li>vanden Berg, B. M., Vink, H., Spaan, J. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+glycocalyx+protects+against+myocardial+edema.">The endothelial glycocalyx protects against myocardial edema.</a> Circulation Research. 92 (6), 592-594 (2003).</li><li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+impact+of+membrane+microtopology+on+effective+two-dimensional+affinity.">Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity.</a> J. Biol. Chem. 276 (16), 13283-138 (2001).</li><li>Vink, H., Duling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Distinct+Luminal+Domains+for+Macromolecules,+Erythrocytes,+and+Leukocytes+Within+Mammalian+Capillaries.">Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries.</a> Circulation Research. 79, 581-589 (1996).</li></ol>

Vi brukte verdier beregnet fra to-lags modell og Hertz teori å modellere samspill av en leukocytt sirkulerer i blodet med den endoteliale vegg. Vi har beregnet at en microvillus på leukocytt med en diameter på 50 nm under en 10 pN belastning ville rykke ca 150 nm i glycocalyx, bare en brøkdel av den totale tykkelse. Dette indikerer at glycocalyx, med egenskaper målt i dette forsøk, er en betydelig hindring for celle-celle interaksjon og kan være en stor sterisk hindring som cellene må overvinne under adhesjonen ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens / Material </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> McCoys Medium </td><td> Gibco </td><td> 16600-082 </td><td></td></tr><tr><td> Kalvefosterserum </td><td> Hyclone </td><td> SH30070 </td><td></td></tr><tr><td> Endotelial cellevekst Medium </td><td> Vec Technologies </td><td> MCDB-131 </td><td></td></tr><tr><td> Humane umbilical vein endotelceller </td><td> Vec Technologies </td><td> PHUVEC/T-25 </td><td></td></tr><tr><td> Svovelsyre </td><td> JT Baker </td><td> 9681-02 </td><td></td></tr><tr><td> Hydrogenperoksid </td><td> VWR </td><td> BDH3742-1 </td><td></td></tr><tr><td> (3-aminopropyl) silan </td><td> Aldrich </td><td> 440140-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Isopropylalkohol </td><td> VWR </td><td> BDH8999-4 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Cellgro </td><td> 25-054-C1 </td><td></td></tr><tr><td> Hank bufret Salt Solution </td><td> Gibco </td><td> 14175-095 </td><td></td></tr><tr><td> sulfo-NHS-LC-Biotin </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21335 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavadin perler </td><td> Dynabeads </td><td> 112.06D </td><td></td></tr><tr><td> MFP-3D AFM </td><td> Asylum Research </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tipless cantilevers </td><td> Nanoworld </td><td> Arrow-TL1-50 </td><td></td></tr><tr><td> Silhouette SD </td><td> QuicKutz </td><td> Silhouette-SD </td><td></td></tr><tr><td> Silikon Rubber </td><td> Stockwell Elastomerics </td><td> SE50-RS </td><td></td></tr><tr><td> 30 ml sprøyter </td&gt; <td> Benton Dickinson </td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> 18 gauge nåler </td><td> Benton Dickinson </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> Forlengelsesslanger </td><td> Hospira </td><td> 4429-48 </td><td></td></tr><tr><td> 4 veis ventiler </td><td> Teleflex </td><td> W21372 </td><td></td></tr><tr><td> Mann / Kvinne Port Caps </td><td> Smiths Medical </td><td> MX491B </td><td></td></tr><tr><td> Peristaltisk pumpe </td><td> Watson-Marlow </td><td> 401U / D </td><td></td></tr><tr><td> Peristaltiske Tubing </td><td> Watson-Marlow </td><td> 903.0016.016 </td><td></td></tr><tr><td> sterilfiltre </td><td> Pall Life Science </td><td> 4652 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantifying the mechanical properties of the endothelial glycocalyx with atomic force microscopy

Forståelsen av samspillet av leukocytter og karveggen under leukocytt fangst er begrenset av en ufullstendig forståelse av de mekaniske egenskapene til den endoteliske overflatelaget. Det er kjent at adhesjonsmolekyler på leukocytter distribueres ikke-jevnt i forhold til overflatetopografien 3, begrenser at topografi klebende binding formasjon med andre overflater 9, og at fysiologiske kontaktkrefter (≈ 5,0 til 10,0 per pN microvillus) kan komprimere microvilli til som lite som en tredjedel av deres hviler lengde, øker tilgjengeligheten av molekyler til den motsatte overflaten 3, 7. Vi anser endotelet som en to-lags struktur, den relativt stive cellelegemét, pluss glycocalyx, en myk beskyttende sukker belegg på luminale flaten 6. Det har blitt vist at glycocalyx kan virke som en barriere for å redusere adhesjon av leukocytter til endotel overflaten 4.I denne rapporten begynner vi å ta opp deformasjon av endothelial overflater å forstå hvordan endothelial mekanisk stivhet kan påvirke bindingen formasjon. Endotelceller dyrket i statisk kultur ikke uttrykke en robust glycocalyx, men celler dyrket under fysiologiske strømningsforhold begynner å omtrentlige glycocalyx observert in vivo 2. Modulus av endotelcelle kroppen har vært målt med atomic force mikroskopi (AFM) å være ca 5-20 kPa 5. Tykkelsen og struktur glycocalyx har blitt studert ved hjelp av elektronmikroskopi 8, og modulus av glycocalyx er omtrentlige ved bruk av indirekte metoder, men så vidt vi vet, har det ikke vært noen publiserte rapporter om en direkte måling av glycocalyx modulus i levende celler . I denne studien, presenterer vi innrykk eksperimenter gjort med en roman AFM sonde på celler som har blitt dyrket i forhold til å maksimere sin glycocalyx uttrykk til make direkte målinger av den modul og tykkelsen på endoteliale glycocalyx.

I et typisk eksperiment ble 20 kraft-vs-avstand kurver oppnådd fra en gitt region av cellen, vanligvis i perinuclear regionen, nær, men ikke på, kjernen (innenfor ~ 2 mm). Kurvene ble justert for å registrere eventuell prøven hviler over varigheten av målingen og så gjennomsnittsberegnet for å fjerne cantilever støy, som vist i figur 4. Kurvene ble analysert og passer med to lags modell som ble utviklet for å bestemme modulus og tykkelse tynn polymer filmer 1. Fra anfall av kurvene ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

De mekaniske egenskapene til endotelial glycocalyx ble målt ved hjelp innrykk mikrometerstørrelse sfærer på AFM cantilevers. Endotelceller ble dyrket i en tilpasset kammer under fysiologiske strømningsforhold for å indusere glycocalyx uttrykk. Data ble analysert ved hjelp av en tynn film for å fastslå den glycocalyx tykkelse og modulus.

Kvantifisere mekaniske egenskaper endotel Glycocalyx med Atomic Force Microscopy

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Måling av mekaniske egenskaper Living Cells hjelp Atomic Force Mikroskopi

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

En ny metode for lokalisering Reporter fluoriserende perler Nær Cell Culture Surface for trekkraft Mikros

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic Force Microscopy Imaging and Force spektroskopi av Supported lipidbilag

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

In Situ Kartlegging av de mekaniske egenskapene til Biofilm av Partikkel-sporing Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Syntese av hydrogeler med Bunn Egenskaper som membraner for vannrensing

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

En Millimeter skala Prøvelegemers bøyestrekkfasthet språk Testing System for å måle mekaniske egenskaper for Marine svamp spiklene

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Biaxial mekanisk Characterizations av atrioventrikulær hjertet ventiler

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Anvendelse av atomic force mikroskopi for å oppdage tidlig slitasjegikt

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...