Name: quantifying the mechanical properties of the endothelial glycocalyx with atomic force microscopy
Uploaded: 2013-02-21T13:00:00
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Os autores gostariam de agradecer a Elena Lomakina, Richard Bauserman, Margaret Youngman, Shay Vaknin, Jessica Snyder, Chris Striemer, Nakul Nataraj, Hung Li Chung, Tejas Khire, e Eric Lam por sua ajuda com este projeto. Este projeto foi financiado pelo NIH # PO1 HL 018208.

1. Métodos Câmara de caudal 1,1 Célula A câmara de fluxo, mostrado na Figura 1, foi construído de modo a que as células podem ser cultivadas sob um corte de 1,0 Pa (10 dyn / cm 2) e, em seguida, transferido directamente para uma Asylum MFP3D AFM (Santa Barbara, CA). <ol><li> A câmara de fluxo foi preparado para o ensaio, em primeiro lugar a limpeza das lâminas de vidro, em solução piranha (3:1 H 2 SO 4: H...

<ol>
	<li>Clifford, C., Seah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoindentation+measurement+of+young's+modulus+for+compliant+layers+on+stiffer+substrates+including+the+effect+of+poisson's+ratios.">Nanoindentation measurement of young's modulus for compliant layers on stiffer substrates including the effect of poisson's ratios.</a> Nanotechnology. , (2009).</li><li>Gouverneur, M., Spaan, J. A. E., Pannekoek, H., Fontijn, R. D., Vink, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+stimulates+incorporation+of+hyaluronan+into+endothelial+cell+glycocalyx.">Fluid shear stress stimulates incorporation of hyaluronan into endothelial cell glycocalyx.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 290 (1), 458-452 (2006).</li><li>Hocde, S. A., Hyrien, O., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecule+distribution+relative+to+neutrophil+surface+topography+assessed+by+tirfm.">Cell adhesion molecule distribution relative to neutrophil surface topography assessed by tirfm.</a> Biophysical Journal. 97 (1), 379-387 (2009).</li><li>Lipowski, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+glycocalyx+as+a+barrier+to+leukocyte+adhesion+and+its+mediation+by+extracellular+proteases.">The endothelial glycocalyx as a barrier to leukocyte adhesion and its mediation by extracellular proteases.</a> Annals of biomedical engineering. 40 (4), 840-848 (2012).</li><li>Lu, L., Oswald, S. J., Ngu, H., Yin, F. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+actin+stress+fibers+in+living+cells.">Mechanical properties of actin stress fibers in living cells.</a> Biophysical Journal. 95 (12), 6060-6071 (2008).</li><li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+surface+layer.">The endothelial surface layer.</a> Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 440 (5), 653-666 (2000).</li><li>Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesive+contact+dependence+on+impingement+force.">Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force.</a> Biophysical Journal. 87 (6), 4237-4245 (2004).</li><li>vanden Berg, B. M., Vink, H., Spaan, J. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+glycocalyx+protects+against+myocardial+edema.">The endothelial glycocalyx protects against myocardial edema.</a> Circulation Research. 92 (6), 592-594 (2003).</li><li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+impact+of+membrane+microtopology+on+effective+two-dimensional+affinity.">Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity.</a> J. Biol. Chem. 276 (16), 13283-138 (2001).</li><li>Vink, H., Duling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Distinct+Luminal+Domains+for+Macromolecules,+Erythrocytes,+and+Leukocytes+Within+Mammalian+Capillaries.">Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries.</a> Circulation Research. 79, 581-589 (1996).</li></ol>

Foram utilizados os valores calculados a partir do modelo de duas camadas e teoria de Hertz para modelar a interacção de um dos leucócitos em circulação no sangue com a parede endotelial. Calculamos que um microvilosidades na leucócitos com um diâmetro de 50 nm sob uma carga de 10 iria pN travessão aproximadamente 150 nm para o glicocálice, apenas uma fracção da espessura total. Isto indica que o glicocálice, com propriedades como medidos nesta experiência, é uma barreira significativa para a interacção ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Material </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Meio de McCoy </td><td> Gibco </td><td> 16600-082 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Calf Serum </td><td> Hyclone </td><td> SH30070 </td><td></td></tr><tr><td> Meio de Crescimento de Células Endoteliais </td><td> Vec Technologies </td><td> MCDB-131 </td><td></td></tr><tr><td> Agrupados células endoteliais da veia umbilical humana </td><td> Vec Technologies </td><td> PHUVEC/T-25 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido sulfúrico </td><td> JT Baker </td><td> 9681-02 </td><td></td></tr><tr><td> Peróxido de Hidrogênio </td><td> VWR </td><td> BDH3742-1 </td><td></td></tr><tr><td> (3-aminopropil) trietoxissilano </td><td> Aldrich </td><td> 440.140-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Álcool isopropílico </td><td> VWR </td><td> BDH8999-4 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Cellgro </td><td> 25-054 C1- </td><td></td></tr><tr><td> Solução salina tamponada de Hank </td><td> Gibco </td><td> 14175-095 </td><td></td></tr><tr><td> sulfo-NHS-LC-Biotina </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21335 </td><td></td></tr><tr><td> Contas Streptavadin </td><td> Dynabeads </td><td> 112.06D </td><td></td></tr><tr><td> MFP-3D AFM </td><td> Asylum Research </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cantilevers Cantilever sem </td><td> Nanoworld </td><td> Arrow-TL1-50 </td><td></td></tr><tr><td> Silhouette SD </td><td> Quickutz </td><td> Silhueta-SD </td><td></td></tr><tr><td> Borracha de silicone </td><td> Stockwell Elastomerics </td><td> SE50-RS </td><td></td></tr><tr><td> Seringas 30 ml </td&gt; <td> Benton Dickinson </td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> 18 agulhas de calibre </td><td> Benton Dickinson </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> Conjuntos de extensão </td><td> Hospira </td><td> 4429-48 </td><td></td></tr><tr><td> Válvulas de 4 vias </td><td> Teleflex </td><td> W21372 </td><td></td></tr><tr><td> Masculino / Feminino Caps Porto </td><td> Smith Medical </td><td> MX491B </td><td></td></tr><tr><td> Bomba peristáltica </td><td> Watson-Marlow </td><td> 401U / D </td><td></td></tr><tr><td> Tubulação Peristaltic </td><td> Watson-Marlow </td><td> 903.0016.016 </td><td></td></tr><tr><td> filtros estéreis </td><td> Ciências da Vida Pall </td><td> 4652 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantifying the mechanical properties of the endothelial glycocalyx with atomic force microscopy

Nossa compreensão da interacção de leucócitos e da parede do vaso durante a captura de leucócitos é limitada por uma compreensão incompleta das propriedades mecânicas da camada de superfície endotelial. Sabe-se que as moléculas de adesão nos leucócitos estão distribuídos de maneira não uniforme em relação à superfície topografia 3, que a topografia limita a formação da ligação adesiva com superfícies de outros 9, e que as forças de contacto fisiológicas (≈ 5,0-10,0 pN por microvilosidades) pode comprimir os microvilos como menos de um terço do seu comprimento de repouso, o aumento da acessibilidade das moléculas para a superfície oposta 3, 7. Consideramos que o endotélio como uma estrutura de duas camadas, o corpo da célula, relativamente rígida, mais o glicocálice, um revestimento de açúcar mole protectora na superfície luminal 6. Tem sido demonstrado que o glicocálice pode actuar como uma barreira para reduzir a adesão de leucócitos ao endotélio de superfície 4.Neste relatório, nós começamos a abordar a deformabilidade de superfícies endoteliais para entender como a rigidez mecânica endotelial pode afetar a formação de vínculo. As células endoteliais em cultura estática não expressam uma glicocálice robusto, mas as células cultivadas em condições de fluxo fisiológicas começam a aproximar o glicocálice observada in vivo 2. O módulo de elasticidade do corpo de célula endotelial foi medida através de microscopia de força atómica (AFM) ser aproximadamente de 5 a 20 kPa 5. A espessura e estrutura do glicocálice foram estudadas utilizando microscopia electrónica de 8, e o módulo de elasticidade do glicocálice foi aproximada usando métodos indirectos, mas o nosso conhecimento, não existem relatos na literatura de uma medição directa do módulo glicocálice em células vivas . No presente estudo, nós apresentamos experiências feitas com um recuo AFM novel sonda em células que foram cultivadas em condições de maximizar a sua expressão glicocálice de maas medições directas ke do módulo e da espessura do glicocálice endotelial.

Numa experiência típica, 20 força-vs-distância curvas foram obtidas a partir de uma dada região de célula, tipicamente na região perinuclear, próximo, mas não sobre, o núcleo (dentro de ~ ^ M 2). As curvas foram alinhados para levar em conta qualquer variação de amostra ao longo da duração da medição e, em seguida, em média, para remover o ruído cantilever, como mostrado na Figura 4. As curvas foram analisadas e se encaixam com o modelo de duas camadas que foi desenvolvido para determi...

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Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

As características mecânicas do glicocálice endotelial foi medida através da indentação utilizando esferas micronizadas em cantilevers de AFM. As células endoteliais foram cultivadas numa câmara de costume em condições de fluxo fisiológicas para induzir a expressão de glicocálice. Os dados foram analisados ​​utilizando um modelo de película fina, para determinar a espessura e módulo de glicocálice.

Quantificar as propriedades mecânicas do Glicocálix endotelial com Microscopia de Força Atômica

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

A imobilização de bactérias for Imaging por Microscopia de Força Atômica

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Bioengenharia

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Visualização do DNA recombinante e Complexos de Proteínas Usando Microscopia de Força Atômica

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Medir as propriedades mecânicas das células vivas Usando Microscopia de Força Atômica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Um novo método para localizar Repórter fluorescentes Beads perto da superfície de cultivo celular para Tração Microscopia de Força

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Projeção de imagem atômica e força Espectroscopia de Bicamadas Lipídicas suportados

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Em Situ Mapeamento das propriedades mecânicas de biofilmes por de rastreamento de partículas Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Síntese de hidrogeles com propriedades anti-deposição como membranas de purificação de água

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

Um milímetro escala Flexural sistema de testes para medir as propriedades mecânicas de espículas de esponja marinha

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Biaxial caracterizações mecânicas das válvulas cardíacas Atrioventricular

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Aplicação de microscopia de força atômica para detectar osteoartrite precoce

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...