Name: quantifying the mechanical properties of the endothelial glycocalyx with atomic force microscopy
Uploaded: 2013-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Författarna vill tacka Elena Lomakina, Richard Bauserman, Margaret Youngman, Shay Vaknin, Jessica Snyder, Chris Striemer, Nakul Nataraj, Hung Li Chung, Tejas Khire, och Eric Lam för deras hjälp med detta projekt. Detta projekt har finansierats av NIH # PO1 HL 018.208.

1. Metoder 1,1 cellflödet kammare En flödeskammare, som visas i figur 1, konstruerades så att celler kunde odlas under en skjuvning av 1,0 Pa (10 dyn / cm 2) och överfördes sedan direkt till en asyl MFP3D AFM (Santa Barbara, CA). <ol><li> Flödeskammaren har upprättats för experimentet genom att först rengöra glasskivor i piraya lösning (3:1 H 2 SO 4: H 2 O 2) under 15 minuter och se...

<ol>
	<li>Clifford, C., Seah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoindentation+measurement+of+young's+modulus+for+compliant+layers+on+stiffer+substrates+including+the+effect+of+poisson's+ratios.">Nanoindentation measurement of young's modulus for compliant layers on stiffer substrates including the effect of poisson's ratios.</a> Nanotechnology. , (2009).</li><li>Gouverneur, M., Spaan, J. A. E., Pannekoek, H., Fontijn, R. D., Vink, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+stimulates+incorporation+of+hyaluronan+into+endothelial+cell+glycocalyx.">Fluid shear stress stimulates incorporation of hyaluronan into endothelial cell glycocalyx.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 290 (1), 458-452 (2006).</li><li>Hocde, S. A., Hyrien, O., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecule+distribution+relative+to+neutrophil+surface+topography+assessed+by+tirfm.">Cell adhesion molecule distribution relative to neutrophil surface topography assessed by tirfm.</a> Biophysical Journal. 97 (1), 379-387 (2009).</li><li>Lipowski, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+glycocalyx+as+a+barrier+to+leukocyte+adhesion+and+its+mediation+by+extracellular+proteases.">The endothelial glycocalyx as a barrier to leukocyte adhesion and its mediation by extracellular proteases.</a> Annals of biomedical engineering. 40 (4), 840-848 (2012).</li><li>Lu, L., Oswald, S. J., Ngu, H., Yin, F. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+actin+stress+fibers+in+living+cells.">Mechanical properties of actin stress fibers in living cells.</a> Biophysical Journal. 95 (12), 6060-6071 (2008).</li><li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+surface+layer.">The endothelial surface layer.</a> Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 440 (5), 653-666 (2000).</li><li>Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesive+contact+dependence+on+impingement+force.">Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force.</a> Biophysical Journal. 87 (6), 4237-4245 (2004).</li><li>vanden Berg, B. M., Vink, H., Spaan, J. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+glycocalyx+protects+against+myocardial+edema.">The endothelial glycocalyx protects against myocardial edema.</a> Circulation Research. 92 (6), 592-594 (2003).</li><li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+impact+of+membrane+microtopology+on+effective+two-dimensional+affinity.">Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity.</a> J. Biol. Chem. 276 (16), 13283-138 (2001).</li><li>Vink, H., Duling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Distinct+Luminal+Domains+for+Macromolecules,+Erythrocytes,+and+Leukocytes+Within+Mammalian+Capillaries.">Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries.</a> Circulation Research. 79, 581-589 (1996).</li></ol>

Vi använde värden beräknade från två skikt modell och Hertz teori att modellera interaktionen av en leukocyt som cirkulerar i blodet med den endoteliala väggen. Vi har räknat ut att en microvillus på leukocyt med en diameter av 50 nm under en 10 pN belastning skulle strecksatsen ungefär 150 nm i glykocalyx, endast en bråkdel av den totala tjockleken. Detta tyder på att glykocalyx, med egenskaper som mäts i detta experiment, är ett betydande hinder för cell-cell-interaktion och kan vara en stor steriskt hin...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på reagens / material </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> McCoys medium </td><td> Gibco </td><td> 16600-082 </td><td></td></tr><tr><td> Fetalt kalvserum </td><td> Hyclone </td><td> SH30070 </td><td></td></tr><tr><td> Endotelcelltillväxt Medium </td><td> Vec Technologies </td><td> MCDB-131 </td><td></td></tr><tr><td> Sammanslagna Human umbilikala venendotelceller </td><td> Vec Technologies </td><td> PHUVEC/T-25 </td><td></td></tr><tr><td> Svavelsyra </td><td> JT Baker </td><td> 9681-02 </td><td></td></tr><tr><td> VÄTESUPEROXID </td><td> VWR </td><td> BDH3742-1 </td><td></td></tr><tr><td> (3-aminopropyl) trietoxisilan </td><td> Aldrich </td><td> 440.140-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Isopropylalkohol </td><td> VWR </td><td> BDH8999-4 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Cellgro </td><td> 25-054-C1 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks buffrad saltlösning </td><td> Gibco </td><td> 14175-095 </td><td></td></tr><tr><td> sulfo-NHS-LC-biotin </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21.335 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavadin pärlor </td><td> Dynabeads </td><td> 112.06D </td><td></td></tr><tr><td> MFP-3D AFM </td><td> Asyl Forskning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tipless utliggare </td><td> Nanoworld </td><td> PIL-TL1-50 </td><td></td></tr><tr><td> Silhouette SD </td><td> Quickutz </td><td> Silhouette-SD </td><td></td></tr><tr><td> Silikongummi </td><td> Stockwell Elastomerics </td><td> SE50-RS </td><td></td></tr><tr><td> 30 ml sprutor </td&gt; <td> Benton Dickinson </td><td> 309.650 </td><td></td></tr><tr><td> 18 gauge nålar </td><td> Benton Dickinson </td><td> 305.196 </td><td></td></tr><tr><td> Extension set </td><td> Hospira </td><td> 4429-48 </td><td></td></tr><tr><td> 4 vägsventiler </td><td> Teleflex </td><td> W21372 </td><td></td></tr><tr><td> Man / kvinna Port Caps </td><td> Smiths Medical </td><td> MX491B </td><td></td></tr><tr><td> Peristaltisk pump </td><td> Watson-Marlow </td><td> 401U / D </td><td></td></tr><tr><td> Peristaltisk Tubing </td><td> Watson-Marlow </td><td> 903.0016.016 </td><td></td></tr><tr><td> sterila filter </td><td> Pall Life Science </td><td> 4652 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantifying the mechanical properties of the endothelial glycocalyx with atomic force microscopy

Vår förståelse av växelverkan mellan leukocyter och kärlväggen under leukocyt infångning begränsas av en ofullständig förståelse av de mekaniska egenskaperna hos den endoteliala ytskiktet. Det är känt att adhesionsmolekyler på leukocyter fördelas olikformigt i förhållande till yttopografi 3, begränsar att topografin vidhäftande bindningsbildning med andra ytor 9, och att fysiologiska kontaktkrafter (≈ 5,0 till 10,0 pN per microvillus) kan komprimera mikrovilli till som lite som en tredjedel av deras vilande längd, öka tillgängligheten av molekyler till den motstående ytan 3, 7. Vi anser endotelet som en två-skiktad struktur, den relativt styva cellkroppen, plus glykocalyx, en mjuk skyddande sockerbeläggning på den luminala ytan 6. Det har visats att glykocalyx kan verka som en barriär för att minska adhesionen av leukocyter till endotelytan 4.I denna rapport har vi börjar ta itu med deformerbarheten av endotelceller ytor att förstå hur endotel mekaniska styvheten kan påverka bindningsbildning. Endotelceller odlade i statisk kultur uttrycker inte en robust glykokalyx, men celler som odlas under fysiologiska flödesbetingelser börjar approximera glykokalyx observerats in vivo 2. Modulen av endotelcell organet har mätts med atomkraftsmikroskopi (AFM) för att vara ca 5 till 20 kPa 5. Tjocklek och struktur glykocalyx har studerats med användning av elektronmikroskopi 8, och modulen för glykocalyx har approximeras med indirekta metoder, men till vår kännedom, har inga publicerade rapporter om en direkt mätning av glykokalyx modulen i levande celler . I denna studie, presenterar vi indrag experiment gjorda med en ny sond AFM på celler som har odlats under förhållanden för att maximera deras glykocalyx uttryck att make direkta mätningar av modul och tjockleken av den endoteliala glykokalyx.

I ett typiskt experiment, var 20 kraft-mot-avstånd kurvor erhållna från en viss region av cellen, typiskt i den perinukleära regionen, nära, men inte på, kärnan (inom ~ 2 um). Kurvorna anpassades med hänsyn till eventuellt prov avdrift under hela mätningen och sedan medelvärdet för avlägsnande fribärande brus, såsom visas i figur 4. Kurvorna analyserades och passar med två skikt modell som utvecklats för att bestämma modulen och tjockleken av den tunna polymerfilmer 1. Från ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

De mekaniska egenskaperna hos endotel glykokalyx mättes med indrag hjälp micron storlek sfärer på AFM utliggare. Endotelceller odlades i en anpassad kammare under fysiologiska flödesbetingelser att inducera uttryck glykokalyx. Data analyserades med användning av en tunn film modell för att bestämma den glykokalyxen tjocklek och modul.

Kvantifiering De mekaniska egenskaperna hos den endoteliala glykokalyx med atomkraftsmikroskopi

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

Bakteriell Immobilisering for Imaging genom atomkraftsmikroskopi

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Visualisering av Rekombinant DNA och proteinkomplex Använda atomkraftsmikroskopi

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mätning av mekaniska egenskaper i levande celler Använda Atomkraftsmikroskopi

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

En ny metod för att lokalisera Reporter Fluorescent Pärlor Nära Cell Culture Yta för Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic Force Microscopy Imaging och Force-spektra enligt stöds lipiddubbelskikt

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

In situ Kartläggning av de mekaniska egenskaperna hos Biofilmer av Partikel-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Syntes av Hydrogeler med Antifouling egenskaper som Membran för vattenrening

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

En Millimeter skala böjhållfasthet testsystem för att mäta de mekaniska egenskaperna hos marina svampen benbalkar

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Biaxial mekaniska karakteriseringar av atrioventrikulärt hjärtklaffar

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Tillämpning av Atomkraft mikroskopi för att upptäcka tidig artros

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...