Name: rna in situ hybridization in whole mount embryos and cell histology adapted for marine elasmobranchs
Uploaded: 2013-04-12T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs at JoVE.com

Gostaria de agradecer os muitos estudantes de graduação que tenham trabalhado em meu laboratório e contribuiu para a evolução destes protocolos. NAT recebeu o apoio da Rede Skidmore-União, um projeto criado com um avanço de NSF PAGO subvenção.

I. Mount RNA Total de hibridação in situ em Elasmobranchs Marinhas 1. Fixação embrião e Preparação <ol><li> Embriões de skate pode ser encenado de acordo com Ballard 7. Fases óptimas para a detecção da expressão do gene depende do tecido de interesse. Para acompanhar a expressão do gene no trato digestivo de skate, 27-30 estágios são óptimas 7. </li><li> Dissecar embriões em PBS, separando os embriões a partir do saco vitelino. </li><l...

<ol>
	<li>Forester, R., Goldstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+osmoregulatory+role+of+amino+acids+and+urea+in+marine+elasmobranchs.">Intracellular osmoregulatory role of amino acids and urea in marine elasmobranchs.</a> Am. J. Physiol. 230, 925-931 (1976).</li><li>Shuttleworth, T., Shuttleworth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physiology of elasmobranch fishes. , 171-194 (1988).</li><li>Yancey, P. H., Clark, M. E., Hand, S. C., Bowlus, R. D., Somero, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+with+water+stress:+evolution+of+osmolyte+systems.">Living with water stress: evolution of osmolyte systems.</a> Science. 217, 1214-1222 (1982).</li><li>Ballatori, N., Villalobos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+molecular+and+cellular+basis+of+toxicity+using+comparative+models.">Defining the molecular and cellular basis of toxicity using comparative models.</a> Toxicl. Appl. Pharmacol. 183, 207-220 (2002).</li><li>Nieto, M. A., Patel, K., Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+analysis+of+chick+embryos+in+whole+mount+and+tissue+sections.">In situ hybridization analysis of chick embryos in whole mount and tissue sections.</a> Methods Cell Biol. 51, 219-235 (1996).</li><li>Jass, J. R., Walsh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mucin+expression+in+the+gastrointestinal+tract:+a+review.">Altered mucin expression in the gastrointestinal tract: a review.</a> J Cell Mol Med. 5, 327-351 (2001).</li><li>Ballard, W. W., Mellinger, J., Lechenault, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+for+development+of+Scyliorhinus+canicula,+the+lesser+spotted+dogfish+(Chondrichthyes;+Scyliorhinidae).">A series of normal stages for development of Scyliorhinus canicula, the lesser spotted dogfish (Chondrichthyes; Scyliorhinidae).</a> J. Exp. Zool. 267, 318-336 (1993).</li><li>Echelard, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog,+a+member+of+a+family+of+putative+signaling+molecules,+is+implicated+in+the+regulation+of+CNS+polarity.">Sonic hedgehog, a member of a family of putative signaling molecules, is implicated in the regulation of CNS polarity.</a> Cell. 75, 1417-1430 (1993).</li><li>Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+mediates+the+polarizing+activity+of+the+ZPA.">Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA.</a> Cell. 75, 1401-1416 (1993).</li><li>Theodosiou, N. A., Hall, D. A., Jowdry, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+acid+mucin+goblet+cell+distribution+and+Hox13+expression+patterns+in+the+developing+vertebrate+digestive+tract.">Comparison of acid mucin goblet cell distribution and Hox13 expression patterns in the developing vertebrate digestive tract.</a> J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 308, 442-453 (2007).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+7.">Ch. 7.</a> Molecular Cloning; A Laboratory Manual. 1, 7.82 (2001).</li><li>Zhang, G., Miyamoto, M. M., Cohn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamprey+type+II+collagen+and+Sox9+reveal+an+ancient+origin+of+the+vertebrate+collagenous+skeleton.">Lamprey type II collagen and Sox9 reveal an ancient origin of the vertebrate collagenous skeleton.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3180-3185 (2006).</li><li>Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histotechnology. , (1980).</li><li>Theodosiou, N. A., Simeone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+a+rudimentary+colon+in+the+elasmobranch,+Leucoraja+erinacea.">Evidence of a rudimentary colon in the elasmobranch, Leucoraja erinacea.</a> Dev. Genes Evol. 222, 237-243 (2012).</li><li>Filipe, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucins+in+the+human+gastrointestinal+epithelium:+a+review.">Mucins in the human gastrointestinal epithelium: a review.</a> Invest. Cell Pathol. 2, 195-216 (1979).</li><li>Corfield, A. P., Wagner, S. A., Clamp, J. R., Kriaris, M. S., Hoskins, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucin+degradation+in+the+human+colon:+production+of+sialidase,+sialate+O-acetylesterase,+N-acetylneuraminate+lyase,+arylesterase,+and+glycosulfatase+activities+by+strains+of+fecal+bacteria.">Mucin degradation in the human colon: production of sialidase, sialate O-acetylesterase, N-acetylneuraminate lyase, arylesterase, and glycosulfatase activities by strains of fecal bacteria.</a> Infect. Immun. 60, 3971-3978 (1992).</li><li>Reid, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+and+histological+progression+to+malignancy+in+Barrett's+esophagus:+prospective+endoscopic+surveillance+of+a+cohort.">Flow-cytometric and histological progression to malignancy in Barrett's esophagus: prospective endoscopic surveillance of a cohort.</a> Gastroenterology. 102, 1212-1219 (1992).</li><li>Mowry, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+staining+of+pancreatic+beta-cell+granules.+Evolution+and+present+status.">Selective staining of pancreatic beta-cell granules. Evolution and present status.</a> Arch. Pathol. Lab Med. 107, 464-468 (1983).</li><li>Roberts, D. J., Smith, D. M., Goff, D. J., Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+signaling+during+the+regionalization+of+the+chick+gut.">Epithelial-mesenchymal signaling during the regionalization of the chick gut.</a> Development. 125, 2791-2801 (1998).</li></ol>

Os protocolos apresentados são os métodos clássicos para monitorar a expressão de genes e identificação de tipos de células diferenciadas, e têm sido adaptadas para utilização em elasmobrânquios marinhos. Outras modificações destes protocolos pode ser necessária para se adaptar a diferentes espécies de elasmobrânquios. A preocupação mais comum em relação a todo o RNA mount in situ &#39;s é o risco de contaminação por RNase e assim a degradação da sonda de RN...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 x transcription buffer</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11-465-384-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DIG-RNA labeling mix</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11-277-073-910</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNAse inhibitor</td>
 <td>Roche</td>
 <td>03-335-399-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNA polymerase - SP6</td>
 <td>Roche</td>
 <td>10-810-274-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNAseI, RNAse-free </td>
 <td>Roche</td>
 <td>10-776-785-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Yeast RNA</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15401-029</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHAPS</td>
 <td>EMD-Millipore</td>
 <td>220201</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>heparin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H4784</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEPC (diethyl pyrocarbonate)</td>
 <td>Research Organics</td>
 <td>2106D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Moria Perforated Spoon</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>10370-17</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Netwell inserts</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>64713-00</td>
 <td>Netwells for use in 6-well tissue culture dishes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-well tissue culture plate</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass scintillation vials with screw-cap lids</td>
 <td>Weaton Science Products</td>
 <td>986540</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>formamide</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP227500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Proteinase K</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>59895 (AM2542)</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NBT</td>
 <td></td>
 <td>11585029001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BCIP</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11585002001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrogen peroxide, 30%</td>
 <td>EMD</td>
 <td>HX0635-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sheep serum</td>
 <td>VWR</td>
 <td>101301-478</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>glutaraldehyde</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G5882</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>tRNA</td>
 <td>Roche</td>
 <td>10-109-541-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-DIG Fab Fragments</td>
 <td>Roche</td>
 <td>1137-6623</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ's.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>26323-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclear Fast Red</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>26078-05</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPX Mountant</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>13510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraffin (Paraplast X-tra)</td>
 <td>McCormick Scientific</td>
 <td>39503002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10% Formalin, NBF</td>
 <td>VWR</td>
 <td>95042-908</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass scintillation vials with screw-cap lids</td>
 <td>Weaton Science Products</td>
 <td>986540</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stainless steal base molds</td>
 <td>Tissue-Tek</td>
 <td>4161-4165</td>
 <td>Multiple sizes available.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cassettes </td>
 <td>Tissue-Tek</td>
 <td>4170</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Slide warmer</td>
 <td>Fisher-Scientific</td>
 <td>12-594Q</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue Embedder</td>
 <td>Leica Microsystems</td>
 <td>EG1160</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microtome, rotary</td>
 <td>Leica Microsystems</td>
 <td>RM2235</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue-Tek Slide Staining Set</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>62540-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue-Tek 24-Slide Holder</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>62543-06</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Superfrost*Plus slides</td>
 <td>Fisherbrand</td>
 <td>12-550-17</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

rna in situ hybridization in whole mount embryos and cell histology adapted for marine elasmobranchs

Elasmobrânquios marinhos são avaliados modelos animais para estudos biomédicos e genômica, como eles são os vertebrados mais primitivos para ter imunidade adaptativa e ter mecanismos exclusivos para osmorregulação 1-3. Como as mais primitivas de vida mandibulados-vertebrados com apêndices pareados, elasmobrânquios são um modelo evolutivo importante, especialmente para estudos em evolução e desenvolvimento. Elasmobrânquios marinhos também têm sido utilizados para estudar toxicologia aquática e fisiologia stress em relação a 4 alterações climáticas. Assim, o desenvolvimento e adaptação de metodologias é necessário para facilitar e ampliar o uso destes vertebrados primitivos para várias disciplinas biológicas. Aqui I apresentam a capacidade de adaptação do RNA montagem inteira de hibridação in situ e de técnicas histológicas para estudar a expressão do gene e histologia de células em elasmobrânquios. Monitorando a expressão do gene é uma ferramenta de cunho biol desenvolvimentoogists, e é amplamente utilizada para investigar os processos de desenvolvimento 5. RNA montagem inteira de hibridação in situ, permite uma visualização e localização de transcritos de genes específicos nos tecidos do embrião em desenvolvimento. O padrão de expressão da mensagem de um gene pode fornecer uma visão do que os processos de desenvolvimento e decisões destino da célula um gene pode controlar. , Comparando o padrão de expressão de um gene em diferentes fases de desenvolvimento, a percepção pode ser adquirida na forma de um papel a alterações dos genes durante o desenvolvimento. Enquanto todo montagem in situ &#39;s fornece um meio para localizar a expressão do gene ao tecido, técnicas histológicas permitir a identificação de tipos de células diferenciadas e de tecidos. Manchas histológico têm funções variadas. Manchas gerais são utilizadas para realçar a morfologia das células, por exemplo, hematoxilina e eosina para corar geral dos núcleos e do citoplasma, respectivamente. Outras manchas podem destacar célula específicatipos. Por exemplo, o azul alcian mancha relatado no presente artigo é uma mancha amplamente utilizado para identificar mucosaccharides catiônica. A coloração do tracto digestivo com alcian azul pode identificar a distribuição de células caliciformes produtoras de mucosaccharides. Variações na constituintes mucosaccharide em péptidos curtos distinguir células caliciformes por função dentro do tracto digestivo 6. Usando RNA montagem inteira métodos in situ &#39;s e histoquímicas simultaneamente, as decisões do destino das células pode ser ligado ao gene a expressão específica. Apesar de RNA in situ &#39;s e histoquímica são amplamente utilizados por pesquisadores, sua adaptação e utilização em elasmobrânquios marinhos encontraram sucesso limitado e variada. Aqui eu apresento protocolos desenvolvidos para elasmobrânquios e usado em uma base regular em meu laboratório. Embora a modificação adicional do RNA in situ o método de hibridação pode ser necessária para se adaptar a diferentes espécies, os protocolos aqui descritos provide um forte ponto de partida para pesquisadores que querem adaptar o uso de elasmobrânquios marinhos para suas investigações científicas.

Exemplos de coloração com azul de alcian em diferentes regiões do L. trato digestivo erinacea são mostrados na Figura 2. Mucina ácida contendo células globlet são claramente visíveis pelo alcian azul mancha ao longo do trato digestivo. A distribuição das mucinas ácidas difere em diferentes regiões do tracto digestivo, o que reflecte diferenças na função. Mucinas ácidas são escassamente produzido no intestino e cloaca espiral, enquanto que uma alta concentração de muc...

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RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Através da combinação de métodos para a montagem de toda RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hibridação e histologia, a expressão do gene pode estar relacionada com as decisões celulares destino no embrião em desenvolvimento. Estes métodos têm sido adaptados para elasmobrânquios marinhos e facilitar o uso desses animais como organismos-modelo para estudos de toxicologia, biomédicas e comparativo.

RNA<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridação em embriões de Mount inteiros e histologia de células Adaptado para Elasmobrânquios Marinhos

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

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