Name: ex vivo red blood cell hemolysis assay for the evaluation of ph-responsive endosomolytic agents for cytosolic delivery of biomacromolecular drugs
Uploaded: 2013-03-09T14:00:00
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Les auteurs remercient le financement par l&#39;intermédiaire du ministère de la Défense dirigé par le Congrès programmes de recherche médicale (# W81XWH-10-1-0445), National Institutes of Health (NIH R21 HL110056) et l&#39;American Heart Association (# 11SDG4890030).

1. Préparation et stérilisation des tampons et des agents de test <ol><li> NaCl 150 mM tampon: dissoudre 4,383 g de cristaux de NaCl dans 500 ml d&#39;eau nanopure. </li><li> Tampons pH: Préparation des tampons phosphate à pH 5,6, 6,2, 6,8, et 7,4 en mélangeant des quantités appropriées d&#39;monobasique et de phosphate de sodium dibasique. Si les échantillons doivent être testés à des valeurs de pH plus faibles (c.-à pH &lt;5,6), puis un tampon plus approprié, comme un tampon citrate, doit être...

<ol>
	<li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2002).</li><li>Boasson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Bacteriolysis+by+Lysozyme.">On the Bacteriolysis by Lysozyme.</a> The Journal of Immunology. 34, 281-293 (1938).</li><li>Convertine, A. J., Benoit, D. S., Duvall, C. L., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+endosomolytic+diblock+copolymer+for+siRNA+delivery.">Development of a novel endosomolytic diblock copolymer for siRNA delivery.</a> J. Control. Release. 133, 221-229 (2009).</li><li>Duvall, C. L., Convertine, A. J., Benoit, D. S., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Delivery+of+a+Proapoptotic+Peptide+via+Conjugation+to+a+RAFT+Synthesized+Endosomolytic.">Intracellular Delivery of a Proapoptotic Peptide via Conjugation to a RAFT Synthesized Endosomolytic.</a> 7, 468-476 (2010).</li><li>Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemolytic+Activity+of+pH-Responsive+Polymer-Streptavidin+Bioconjugates.">Hemolytic Activity of pH-Responsive Polymer-Streptavidin Bioconjugates.</a> Bioconjugate Chemistry. 10, 401-405 (1999).</li><li>Murthy, N., Campbell, J., Fausto, N., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinspired+pH-responsive+polymers+for+the+intracellular+delivery+of+biomolecular+drugs.">Bioinspired pH-responsive polymers for the intracellular delivery of biomolecular drugs.</a> Bioconjugate chemistry. 14, 412-419 (2003).</li><li>Murthy, N., Robichaud, J. R., Tirrell, D. A., Stayton, P. S., Hoffman, A. 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C., Pastan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH-dependent+lysis+of+liposomes+by+adenovirus.">pH-dependent lysis of liposomes by adenovirus.</a> Biochemistry. 25, 2231-2237 (1986).</li><li>Moore, N. M., Sheppard, C. L., Barbour, T. R., Sakiyama-Elbert, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+endosomal+escape+peptides+on+in+vitro+gene+delivery+of+polyethylene+glycol-based+vehicles.">The effect of endosomal escape peptides on in vitro gene delivery of polyethylene glycol-based vehicles.</a> The Journal of Gene Medicine. 10, 1134-1149 (2008).</li><li>Panyam, J., Zhou, W. Z., Prabha, S., Sahoo, S. K., Labhasetwar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+endo-lysosomal+escape+of+poly(DL-lactide-co-glycolide)+nanoparticles:+implications+for+drug+and+gene+delivery.">Rapid endo-lysosomal escape of poly(DL-lactide-co-glycolide) nanoparticles: implications for drug and gene delivery.</a> The FASEB Journal. 16, 1217-1226 (2002).</li></ol>

pH-sensible polymères ou d&#39;autres agents conçus pour fonction endosomolytique peut être rapidement et efficacement sélectionnés en fonction de lyse des globules rouges à des valeurs de pH rencontrées dans l&#39;endosome (figure 1; pH 6,8 - endosome précoce, pH 6,2 - endosome tardif, pH 5,6 - lysosome). 14-17 dépendante du pH hémolyse a été utilisé pour cribler la capacité des transporteurs à la médiation de libération de médicaments endosomal biomacromolecular (pepti...

Bien qu&#39;il existe de nombreux potentiels à fort impact cibles thérapeutiques à l&#39;intérieur de la cellule, la délivrance intracellulaire d&#39;agents pose un défi de taille. Souvent, les médicaments, les produits biologiques, en particulier sont internalisés par les cellules et la traite dans des vésicules qui soit conduire à une dégradation de leur contenu par la voie endo-lysosomal, ou la navette de retour hors de la cellule par exocytose. 1 Dans ce dernier procédé, le pH interne des vésicules est acidifiée à environ 5-6, qui est le pH optimal pour l&#39;activité des enzymes qui agissent dans ce compartiment, tel que le lysozyme. 2 Récemment, un certain nombre de matériaux ont été spécialement conçues pour tirer parti de l&#39;acidification des endosomes pour faciliter la distribution cytosolique de leur cargaison. Un exemple de cette approche utilise des nanoparticules de polymères synthétiques, des micelles dont l&#39;activité principale est zwitterionique et charge neutre au pH physiologique (c. 7.4). Cependant, à pH 6,0- 6,5, les polymères deviennent protonés et acquérir une charge positive nette qui déstabilise le noyau des micelles, et les segments de polymère exposées interagir avec et désorganiser la membrane de l&#39;endosome. Cette activité a été montré pour favoriser l&#39;évasion endosomal des peptides et des acides nucléiques thérapeutiques à base leur permettant d&#39;accéder à leurs cibles cytosoliques. 3,4 D&#39;autres exemples de méthodes élaborées pour servir de médiateur évasion endosomal qui perturbent la barrière de la membrane comprennent fusogènes &#39;«peptides ou protéines qui peuvent médier la fusion membranaire ou transitoire formation de pores dans la bicouche phospholipidique. 5 Homopolymères de anioniques acides acryliques d&#39;alkyle tels que le poly (acide propylacrylique) sont une autre approche bien étudiée, et dans ces polymères, l&#39;état de protonation de l&#39;acide carboxylique pendant dicte transition dans un hydrophobe, membrane interruption de l&#39;État dans des gammes de pH endo-lysosomal. 6,7 Un système modèle utile pour le criblage comportement endosomolytique est l&#39;ex dépendante du pH in vivo hémolyse dosage. 8 Dans ce système modèle, la membrane érythrocytaire sert de substitut pour la membrane bicouche lipidique qui entourent endo-lysosomal vésicules. Ce modèle généralisable a été utilisé par d&#39;autres pour évaluer le comportement endosomolytique des peptides de pénétration cellulaire et d&#39;autres polymères de systèmes de transfert de gènes. 8-11 Dans cette expérience, les globules rouges humains et matériels de test sont co-incubées dans des tampons à des pH définis qui imitent extracellulaires (7,4), au début des endosomes (6,8), et la fin de l&#39;endo-lysosomal (&lt;6,8) environnements. La quantité d&#39;hémoglobine libérée au cours de la période d&#39;incubation est quantifié comme une mesure de la lyse des globules rouges, qui est normalisée à la quantité d&#39;hémoglobine libérée dans les échantillons témoins positifs lysées avec un détergent. De criblage d&#39;une petite bibliothèque de matériaux d&#39;essais potentiellement endosomolytiques, on peut en déduire que les échantillons qui produisent aucune hémolyse à pH 7,4, mais l&#39;ourlet significativement élevéolysis à pH &lt;6,5, seront les candidats les plus efficaces et cytocompatible pour l&#39;administration de médicaments cytosolique. Les matériaux qui répondent à ces critères on peut s&#39;attendre à rester inerte et non pas aveuglément détruire membranes bicouches lipidiques (c. qui pourrait provoquer une cytotoxicité) avant d&#39;être exposé à une baisse du pH local après internalisation dans l&#39;endo-lysosomal compartiments. Dans ce protocole, les érythrocytes sont isolés à partir d&#39;un donneur humain et co-incubée à pH 5,6, 6,2, 6,8, ou 7,4 avec expérimentales endosomolytiques agents de délivrance de médicaments. Érythrocytes intacts sont culottées, et les surnageants (contenant de l&#39;hémoglobine libérée des érythrocytes lysés) sont analysés pour l&#39;absorbance caractéristique de l&#39;hémoglobine par l&#39;intermédiaire d&#39;un lecteur de plaque (figure 1).

<table border="1"><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> BD Vacutainer - Tubes Vacutainer EDTA K2 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-253-145 </td><td> Pour la collecte de sang </td></tr><tr><td> BD Vacutainer Aiguilles de prélèvement sanguin, 20,5 calibre </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-665-31 </td><td> Pour la collecte de sang </td></tr><tr><td> BD Vacutainer Tube Holder / aiguille adaptateur </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-289-953 </td><td> Pour la collecte de sang </td></tr><tr><td> Marque BD Tampons d&#39;alcool isopropylique </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-680-63 </td><td> Pour la collecte de sang </td></tr><tr><td> BD Vacutainer sans latex Tourniquet </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-657-6 </td><td> Pour la collecte de sang </td&gt; </tr><tr><td> L&#39;acide chlorhydrique (conc.) </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144-500 </td><td> Pour le réglage du pH de D-PBS. </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8787 </td><td> Contrôle positif </td></tr><tr><td> PBS Dulbecco </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Nalgene Bouteille à usage unique stérile MF75-Haut Unité de filtration avec membrane SFCA </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09 à 740-44A </td><td></td></tr><tr><td> BD plaques à 96 puits, à fond plat, en polystyrène, de culture de tissu traité </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08 à 772-2C </td><td> Pour plaque de lecture à la fin de l&#39;essai. </td></tr><tr><td> BD plaques à 96 puits, polystyrène à fond rond, de culture de tissu traité </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772-17 </td><td> L&#39;incubation de globules rouges avec des agents expérimentaux. </td></tr></table&gt;

ex vivo red blood cell hemolysis assay for the evaluation of ph-responsive endosomolytic agents for cytosolic delivery of biomacromolecular drugs

Bicouches de phospholipides qui constituent endo-lysosomal vésicules peuvent constituer un obstacle à la livraison de médicaments biologiques à des cibles intracellulaires. Pour surmonter cet obstacle, un certain nombre de transporteurs de drogues synthétiques ont été conçus pour une perturbation active de la membrane de l&#39;endosome et livrer de la marchandise dans le cytoplasme. Ici, nous décrivons le test d&#39;hémolyse, qui peut être utilisé aussi rapide et à haut débit pour l&#39;écran et l&#39;activité cytocompatibilité endosomolytique des systèmes de délivrance de médicaments intracellulaires. Dans l&#39;essai d&#39;hémolyse, des globules rouges humains et des matériaux de test sont co-incubés dans des tampons à des pH définies, qui imitent extracellulaires début endosomes, et la fin de l&#39;endo-lysosomiaux environnements. Après une étape de centrifugation à granulés de globules rouges intacts, la quantité d&#39;hémoglobine libérée dans le milieu est mesurée par spectrophotométrie (405 nm pour la gamme plus dynamique). La perturbation pour cent des globules rouges est ensuite quantifié par rapport au contrôle positif sampLes lysées avec un détergent. Dans ce système, le modèle de la membrane du globule rouge sert de substitut pour la membrane bicouche lipidique qui entourent endo-lysosomal vésicules. Le résultat souhaité est l&#39;hémolyse négligeable à pH physiologique (7,4) et une hémolyse robuste dans la gamme de pH endo-lysosomal d&#39;environ 5 à 6,8 pH.

<html> Typiquement, les agents qui présentent idéal dépendante du pH comportement hémolytique ont le plus grand potentiel pour la livraison de médicaments cytosolique, des acides nucléiques ou d&#39;autres molécules bioactives. Ceci est illustré par l&#39;agent n ° 1 comme représenté à la figure 2, qui présente une hémolyse minimale à un pH de 7,4, mais une forte augmentation des comportements à hémolytique gammes de pH des endosomes (&lt;6,5). Certains agents peuvent présenter des nive...

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Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs

Un essai d&#39;hémolyse ne peut être utilisée comme rapide, à haut débit écran de cytocompatibilité systèmes d&#39;administration de médicaments et de l&#39;activité de la livraison des marchandises endosomolytique intracellulaire. Le test mesure la perturbation des membranes des érythrocytes en fonction du pH de l&#39;environnement.

Ex Vivo globules rouges Assay Hémolyse pour l&#39;évaluation des pH-sensibles agents endosomolytique pour la livraison des médicaments cytosolique Biomacromolecular

Phospholipid bilayers that constitute endo-lysosomal vesicles can pose a barrier to delivery of biologic drugs to intracellular targets. To overcome this ...

Research

JoVE Journal

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Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs

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