Name: ex vivo red blood cell hemolysis assay for the evaluation of ph-responsive endosomolytic agents for cytosolic delivery of biomacromolecular drugs
Uploaded: 2013-03-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs at JoVE.com

Gli autori riconoscono il finanziamento attraverso il Dipartimento della Difesa dal Congresso Regia programmi di ricerca medica (# W81XWH-10-1-0445), National Institutes of Health (NIH R21 HL110056), e American Heart Association (# 11SDG4890030).

1. Preparazione e sterilizzazione di buffer e agenti di test <ol><li> 150 mM NaCl tampone: sciogliere 4,383 g di cristalli di NaCl in 500 ml di acqua Nanopure. </li><li> Buffer pH: Preparare tamponi fosfato a pH 5.6, 6.2, 6.8, e 7.4 mescolando quantità appropriate di monobasico e sodio fosfato bibasico. Se i campioni devono essere sottoposti a valori di pH più bassi (pH &lt;5.6) poi un buffer più appropriato, come il tampone citrato, dovrebbe essere usato. Ricette del buffer sono facilmente disponibili, e ...

<ol>
	<li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2002).</li><li>Boasson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Bacteriolysis+by+Lysozyme.">On the Bacteriolysis by Lysozyme.</a> The Journal of Immunology. 34, 281-293 (1938).</li><li>Convertine, A. J., Benoit, D. S., Duvall, C. L., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+endosomolytic+diblock+copolymer+for+siRNA+delivery.">Development of a novel endosomolytic diblock copolymer for siRNA delivery.</a> J. Control. Release. 133, 221-229 (2009).</li><li>Duvall, C. L., Convertine, A. J., Benoit, D. S., Hoffman, A. 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K., Labhasetwar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+endo-lysosomal+escape+of+poly(DL-lactide-co-glycolide)+nanoparticles:+implications+for+drug+and+gene+delivery.">Rapid endo-lysosomal escape of poly(DL-lactide-co-glycolide) nanoparticles: implications for drug and gene delivery.</a> The FASEB Journal. 16, 1217-1226 (2002).</li></ol>

pH-sensibili polimeri o altri agenti destinati endosomolytic funzione può essere rapidamente ed efficacemente proiettato sulla base di lisi dei globuli rossi a pH incontrate in endosomi (Figura 1; pH 6,8 - endosoma precoce, pH 6,2 - endosoma tardi, pH 5,6 - lisosoma). 14-17 pH-dipendente emolisi è stato utilizzato per schermare la capacità dei vettori di mediare endosomal rilascio di peptidi terapeutici biomacromolecular (ad esempio, siRNA, ODN, proteine), ed i risultati di questa...

Sebbene vi siano molti potenziali obiettivi terapeutici impatto elevato all&#39;interno della cellula, la consegna intracellulare di agenti rappresenta una sfida significativa. Spesso, i farmaci biologici, in particolare, vengono internalizzati dalle cellule e trafficata in vescicole che o portare al degrado del loro contenuto tramite l&#39;endo-lisosomiale via, o vengono trasportati indietro fuori dalla cellula tramite esocitosi. 1 In quest&#39;ultimo processo, il pH interno delle vescicole viene acidificata a circa 5-6, che è il pH ottimale per l&#39;attività di enzimi che funzionano in questo vano, ad esempio il lisozima. 2 Recentemente, un certo numero di materiali sono stati specificamente progettati per sfruttare l&#39;acidificazione di endosomi per facilitare l&#39;erogazione citosolico del loro carico. Un esempio di questo approccio utilizza nanoparticelle polimeriche sintetiche, micelle cui anima è zwitterionici e carica neutra a pH fisiologico (cioè 7,4). Tuttavia, a pH 6,0- 6,5, i polimeri diventano protonati e acquisire una carica positiva netta che destabilizza il nucleo micelle, e segmenti polimerici esposti interagire e distruggere la membrana endosomiale. Questa attività è stato dimostrato per promuovere la fuga endosomiale di peptidi e acido nucleico-terapie basate, consentendo loro di accedere ai bersagli citosolico. 3,4 Altri esempi di metodi sviluppati per mediare fuga endosomiale che distruggere la barriera membrana includono &#39;fusogenico&#39; peptidi o proteine ​​che possono mediare la fusione della membrana o transitoria formazione di pori nel doppio strato fosfolipidico. 5 omopolimeri di acidi acrilici anionici alchile come acido poli (propylacrylic) sono un altro approccio ben studiato, e in questi polimeri, lo stato di protonazione di acido carbossilico detta sospensione transizione in una idrofobica, membrana dirompente stato in endo-lisosomiale intervalli di pH. 6,7 Un sistema modello utile per lo screening di comportamento endosomolytic è l&#39;indirizzox pH-dipendente vivo dosaggio emolisi. 8 In questo sistema modello, la membrana eritrocitaria serve come un surrogato della membrana a doppio strato lipidico che racchiudono endo-vescicole lisosomiali. Questo modello generalizzabile è stato utilizzato da altri per valutare il comportamento endosomolytic di penetrazione cellulare peptidi e altri sistemi polimerici consegna del gene. 8-11 In questo esperimento, globuli rossi umani e materiali di prova sono co-incubate in tampone a pH definiti che mimano extracellulari (7.4), precoce endosomali (6.8), e la fine del endo-lisosomiale (&lt;6.8) ambienti. La quantità di emoglobina rilasciata durante il periodo di incubazione è quantificato come misura di lisi dei globuli rossi, che viene normalizzato alla quantità di emoglobina rilasciata in campioni di controllo positivi lisate con un detergente. Da screening di una piccola libreria di materiali di prova potenzialmente endosomolytic, si può dedurre che i campioni che non producono emolisi a pH 7.4, ma orlo significativamente elevatiolysis a pH &lt;6.5, saranno i candidati più efficaci e cytocompatible per la consegna della droga citosolico. Materiali che soddisfano questi criteri dovrebbe rimanere inerte e non indiscriminatamente distruggere le membrane a doppio strato lipidico (cioè che potrebbe causare citotossicità) fino ad essere esposto ad una diminuzione del pH locale dopo interiorizzazione in endo-compartimenti lisosomiali. In questo protocollo, eritrociti sono isolati da un donatore umano e co-incubate a pH 5,6, 6,2, 6,8, 7,4 o con agenti farmaci sperimentali endosomolytic consegna. Eritrociti intatti sono pellettizzati, ei surnatanti (contenenti emoglobina rilasciata da eritrociti lisati) vengono analizzati per l&#39;assorbanza caratteristica di emoglobina mediante un lettore di piastre (Figura 1).

<table border="1"><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> BD Vacutainer - K2EDTA Vacutainer Tubi </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-253-145 </td><td> Per la raccolta del sangue </td></tr><tr><td> BD Vacutainer sangue aghi di raccolta, 20,5 scartamento </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-665-31 </td><td> Per la raccolta del sangue </td></tr><tr><td> BD Vacutainer tubo porta / ago Adattatore </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-289-953 </td><td> Per la raccolta del sangue </td></tr><tr><td> BD Marca isopropilico tamponi imbevuti di alcool </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-680-63 </td><td> Per la raccolta del sangue </td></tr><tr><td> BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-657-6 </td><td> Per la raccolta del sangue </td&gt; </tr><tr><td> Acido cloridrico (conc.) </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144-500 </td><td> Per la regolazione del pH del D-PBS. </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8787 </td><td> Controllo positivo </td></tr><tr><td> Dulbecco PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Nalgene MF75 sterile monouso Bottle-Top Unità Filtro con membrana SFCA </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-740-44A </td><td></td></tr><tr><td> BD piastre a 96 pozzetti, a fondo piatto, di coltura trattata con polistirolo </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772-2C </td><td> Per piastra di lettura al termine del saggio. </td></tr><tr><td> BD piastre a 96 pozzetti, fondo tondo, di coltura trattata con polistirolo </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772-17 </td><td> Per incubazione di globuli rossi con agenti sperimentali. </td></tr></table&gt;

ex vivo red blood cell hemolysis assay for the evaluation of ph-responsive endosomolytic agents for cytosolic delivery of biomacromolecular drugs

Doppi strati di fosfolipidi che costituiscono endo-lisosomiale vescicole possono rappresentare un ostacolo alla consegna di farmaci biologici a bersagli intracellulari. Per superare questo ostacolo, una serie di trasportatori di farmaci sintetici sono stati progettati per interrompere attivamente la membrana endosomiale e consegnare cargo nel citoplasma. Qui, descriviamo il saggio emolisi, che può essere usato come un rapido, ad alta resa per la schermata citocompatibilità e attività endosomolytic dei sistemi intracellulari drug delivery. Nel saggio emolisi, globuli rossi umani e materiali di prova sono co-incubate in tampone a pH definiti che imitano extracellulari, endosomali precoce e tardiva endo-lisosomiali ambienti. A seguito di una fase di centrifugazione a pellet intatti cellule rosse del sangue, la quantità di emoglobina rilasciata nel terreno viene misurata spettrofotometricamente (405 nm per migliore dinamica). Il rosso per cento rottura delle cellule del sangue viene poi quantificato rispetto al controllo positivo samples lisate con un detergente. In questo sistema modello la membrana eritrocitaria funge da surrogato per la membrana lipidica a due strati che racchiudono endo-lisosomiale vescicole. Il risultato desiderato è emolisi trascurabile a pH fisiologico (7,4) ed emolisi robusta in endo-lisosomiale intervallo di pH da circa pH 5-6,8.

<html> In genere, gli agenti che presentano ideale pH-dipendente comportamento emolitica hanno il più alto potenziale per la consegna citosolico di farmaci, acidi nucleici, o altre molecole bioattive. Questo è esemplificato da Agent # 1 come rappresentato in figura 2, che presenta emolisi minima a pH 7,4, ma un forte aumento comportamento emolitica a intervalli di pH endosomiali (&lt;6,5). Alcuni agenti possono esibire livelli significativi di comportamento emolitica a intervalli di pH fisiologici (Age...

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Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs

Un saggio di emolisi può essere usato come un rapido, ad alta resa di schermo citocompatibilità sistemi di rilascio di farmaci e l&#39;attività endosomolytic per la consegna del carico intracellulare. Il saggio misura la rottura di membrane eritrocitarie in funzione del pH.

Ex Vivo Blood Red emolisi test cellulare per la valutazione degli agenti Endosomolytic pH-sensibile per la consegna dei farmaci citosolico Biomacromolecular

Phospholipid bilayers that constitute endo-lysosomal vesicles can pose a barrier to delivery of biologic drugs to intracellular targets. To overcome this ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs

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