Name: ex vivo red blood cell hemolysis assay for the evaluation of ph-responsive endosomolytic agents for cytosolic delivery of biomacromolecular drugs
Uploaded: 2013-03-09T14:00:00
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著者らは、国防総省を通じて議会監督医学研究プログラム（＃W81XWH-10-1から0445）、国立衛生研究所（NIH R21をHL110056）、および米国心臓協会（＃11SDG4890030）を資金認める。

1。バッファおよびテストエージェントの調製と滅菌<ol><li> 150mMのNaCl緩衝液：ナノ純水500ml中に4.383グラムNaCl結晶を溶かす。 </li><li> pH緩衝液：一塩基と二塩基性リン酸ナトリウムの適切な量を混合することにより、pHが5.6、6.2、6.8、および7.4のリン酸緩衝液を準備します。サンプルは低いpH値（ すなわち pHが&lt;5.6）などのクエン酸緩衝液として、より適切な緩衝液、でテストする場合...

<ol>
	<li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2002).</li><li>Boasson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Bacteriolysis+by+Lysozyme.">On the Bacteriolysis by Lysozyme.</a> The Journal of Immunology. 34, 281-293 (1938).</li><li>Convertine, A. J., Benoit, D. S., Duvall, C. L., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+endosomolytic+diblock+copolymer+for+siRNA+delivery.">Development of a novel endosomolytic diblock copolymer for siRNA delivery.</a> J. Control. Release. 133, 221-229 (2009).</li><li>Duvall, C. L., Convertine, A. J., Benoit, D. S., Hoffman, A. 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-初期エンドソームのpH 6.2 -後期エンドソームのpH 5.6 - pHは6.8、エンドソーム溶解機能のために設計されたpH応答性ポリマーまたは他の薬剤を迅速かつ効果的にエンドソーム（ 図1に遭遇したpH値で赤血球の溶解に基づいてスクリーニングすることができるリソソーム）14から17、pH依存性溶血は、生体高分子の治療法（ 例えば、ペプチドは、siRNA、ODNは、タンパク質）...

細胞内の多くの潜在的な影響力の大きい治療標的がありますが、薬剤の細胞内送達は、重要な課題となっています。頻繁に、薬剤、特に生物学的製剤は、エキソサイトーシスを介して細胞によって内在化および小胞に人身売買どちらのendo-リソソーム経路を介して、それらの内容の劣化につながること、またはセルの裏に運ばれますされています。後者の過程で1、内部のpHが小胞の酵素の活性の至適pHである、約5から6に酸性化されているリゾチームなど、この区画内の関数は、図2 最近では、材料の数は、特にの酸性化は、その貨物の細胞質送達を容易にするエンドソームを活用するように操作されている。このアプローチの一つの例では、コア生理学的pH（ すなわち 7.4）で両性イオンと電荷的に中性である合成、高分子ミセルのナノ粒子を使用しています。しかし、pH6.0で- 6.5、ポリマーがプロトン化になるとミセルのコアを不安定正味の正電荷を取得し、露出したポリマーセグメントと相互作用し、エンドソーム膜を破壊する。この活動は、彼らの細胞質ゾルのターゲットにアクセスできるように、ペプチドおよび核酸ベースの治療薬のエンドソーム脱出を促進することが示されている。膜障壁を崩壊エンドソーム脱出を媒介するために開発された方法の3,4他の例は、または&#39;融合&#39;ペプチドが含まれるリン脂質二重層の膜融合や過渡孔形成を媒介することができるタンパク質は、例えば、ポリ（プロピルアクリル酸）のようなアニオン性アルキルアクリル酸の5ホモは別のよく研究されたアプローチであり、これらのポリマーに、ペンダントカルボン酸のプロトン化状態が遷移を指示エンド-リソソームのpH範囲において、疎水性膜の中断状態になります。6,7 エンドソーム溶解挙動をスクリーニングするための一つの有用なモデル系はeですX生体内pH依存性溶血アッセイ。このモデルシステムでは8、赤血球膜は、エンド-リソソーム小胞を囲む脂質二重膜の代用として機能します。この一般化モデルは細胞透過性ペプチドおよび他の高分子遺伝子送達システムのエンドソーム溶解挙動を評価するために他の人によって使用されています8月11日今回の実験では、ヒト赤血球および試験材料は模倣する定義されたpHで緩衝液中で同時インキュベートアール、（7.4）は、細胞外（6.8）初期エンドソーム、およびエンドリソソーム後期（&lt;6.8）環境に対応しています。潜伏期間中に放出されたヘモグロビンの量は、洗剤を用いて溶解し、陽性対照試料で放出されたヘモグロビンの量に正規化されている赤血球の溶解、の尺度として定量化される。 潜在的にエンドソーム溶解試験材料の小さなライブラリーをスクリーニングすることから、1つは、pH7.4で全く溶血を生じないが、有意に上昇し、その裾のサンプルを推測することができますpHでolysis &lt;6.5は、細胞質ゾルの薬物送達のための最も効果的かつcytocompatible候補となります。これらの基準に適合する材料は、不活性のままで無差別にエンド-リソソーム区画に内在化後の局所pHの低下にさらされるまで、脂質二重膜（細胞毒性を引き起こす可能性がIE）を破壊しないことが予想される。 このプロトコルでは、赤血球はヒトのドナーから単離されており、実験的なエンドソーム溶解薬物送達剤を用いてpHを5.6、6.2、6.8、または7.4で共存培養した。無傷赤血球をペレット化し、上清を（溶解赤血球から放出されたヘモグロビンを含む）プレートリーダー（ 図1）を経由してヘモグロビンの吸光特性を分析する。

<table border="1"><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> BDバキュテイナー - K2EDTAバキュテイナー管</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 22-253-145 </td><td>採血用</td></tr><tr><td> BDバキュテイナ採血針、20.5ゲージ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 02-665-31 </td><td>採血用</td></tr><tr><td> BDバキュテイナチューブホルダー/ニードルアダプタ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 22-289-953 </td><td>採血用</td></tr><tr><td> BDのブランドイソプロピルアルコール綿棒</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 13-680-63 </td><td>採血用</td></tr><tr><td> BDバキュテイナーラテックスフリー止血帯</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 02-657-6 </td><td>採血用</TD&gt; </tr><tr><td>塩酸（濃） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> A144-500 </td><td> D-PBSのpHを調整するための。 </td></tr><tr><td>トリトンX-100 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T8787 </td><td>陽性対照</td></tr><tr><td>ダルベッコPBS </td><td>インビトロジェン</td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td>ナルゲンSFCAメンブレンMF75滅菌使い捨てボトルトップフィルターユニット</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 09から740-44A </td><td></td></tr><tr><td> BDの96ウェルプレート平底、組織培養処理されたポリスチレン</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 08から772-2C </td><td>アッセイの終了時に、板読書のため。 </td></tr><tr><td> BDの96ウェルプレート、丸底組織培養処理されたポリスチレン</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 08-772-17 </td><td>実験的な薬剤と赤血球のインキュベーション。 </td></tr></テーブル&gt;

ex vivo red blood cell hemolysis assay for the evaluation of ph-responsive endosomolytic agents for cytosolic delivery of biomacromolecular drugs

エンド-リソソーム小胞を構成するリン脂質二重層は細胞内標的に対する生物学的薬剤の送達に障壁をもたらすことができます。この障壁を克服するために、合成麻薬キャリアの数を積極的にエンドソーム膜を破壊し、細胞質内に貨物を提供するように設計されています。ここでは、細胞内薬物送達システムのcytocompatibilityとエンドソーム溶解活性のために迅速、ハイスループットスクリーニングとして使用することができ溶血アッセイを、説明します。 溶血アッセイ、ヒト赤血球および試験材料では、細胞外の早期エンドソーム、後期のendo-リソソーム環境を模倣する定義されたpHの緩衝液中で同時インキュベートされています。ペレット無傷赤血球に遠心分離工程に続いて、培地中に放出されたヘモグロビンの量を分光光度法（最高のダイナミックレンジの405 nm）で測定されます。パーセント赤血球の破壊は、その後陽性対照SAMPに対する相対定量化されLESは、洗剤を用いて溶解。このモデル系では赤血球膜には、エンド - リソソーム小胞を囲む脂質二重膜の代用として機能します。所望の結果は、生理学的pH（7.4）とpH約5から6.8からのendo-リソソームのpH範囲で堅牢な溶血で無視できる溶血です。

<html>典型的には、理想的なpH依存性溶血性挙動を示す薬剤は、薬物、核酸、または他の生物活性分子の細胞質送達のための最高の可能性を秘めている。これは、pH7.4で最小限の溶血を示し、 図2に描かエージェントとして第1に代表されるが、エンドソームのpH範囲（&lt;6.5）における溶血性行動が急激に増加しています。これらの薬剤は血液適合性ではない可能性があり、潜在的に?...

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Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs

溶血アッセイは、細胞内の貨物の配達のための薬物送達システム &quot;cytocompatibilityとエンドソーム溶解活性の急速な、高スループットの画面として使用することができます。アッセイは、環境pHの関数としての赤血球膜の破壊を測定します。

生体高分子薬の細胞質ゾルデリバリーのためのpH応答性エンドソーム溶解剤の評価のためにex vivoで赤血球溶血アッセイ

Phospholipid bilayers that constitute endo-lysosomal vesicles can pose a barrier to delivery of biologic drugs to intracellular targets. To overcome this ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs

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