Name: ex vivo red blood cell hemolysis assay for the evaluation of ph-responsive endosomolytic agents for cytosolic delivery of biomacromolecular drugs
Uploaded: 2013-03-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs at JoVE.com

저자는 국방부를 통해 Congressionally 감독 의학 연구 프로그램 (# W81XWH-10-1-0445), 보건 국립 연구소 (NIH R21 HL110056)와 미국 심장 협회 (# 11SDG4890030)를 자금을 인정합니다.

1. 버퍼 및 시험 에이전트의 작성 및 살균 <ol><li> 150 MM NaCl 버퍼 : nanopure 물 500 ML에 4.383 g NaCl의 결정을 디졸브. </li><li> 산도 버퍼 : 일 염기의 및 이염 기성의 인산 나트륨의 적절한 양을 혼합하여 pH를 5.6, 6.2, 6.8 및 7.4에서 인산염 버퍼를 준비합니다. 샘플 등 구연산 버퍼로 다음 낮은 산도 값 (즉, 산도가 &lt;5.6) 더 적절한 버퍼에서 테스트 할 경우 사용되어야합니다. 버퍼 요리법은 쉽게 이?...

<ol>
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K., Labhasetwar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+endo-lysosomal+escape+of+poly(DL-lactide-co-glycolide)+nanoparticles:+implications+for+drug+and+gene+delivery.">Rapid endo-lysosomal escape of poly(DL-lactide-co-glycolide) nanoparticles: implications for drug and gene delivery.</a> The FASEB Journal. 16, 1217-1226 (2002).</li></ol>

endosomolytic 기능을 위해 설계 산도 - 응답 고분자 또는 다른 요원이 신속하게 될 효과적으로 endosome에서 발생 산도 값의 붉은 혈액 세포의 용해 (그림 1을 기준으로 검사를 할 수 있습니다, 산도 6.8 - 초기 endosome, 산도 6.2 - 늦은 endosome, pH를 5.6 - lysosome). 14-17 산도에 따라 달라 용혈은 biomacromolecular의 치료학 (예 : 펩티드, siRNA, ODNs, 단백질)의 endosomal 버전을 중재 할 사업자의...

세포 내부에 많은 잠재적 영향력이 치료 대상이 있지만, 대리인의 세포 내 전달에 중요한 도전을 안겨주고 있습니다. 자주, 약물, 특히 biologics는 exocytosis를 통해 세포에 의해 internalized와 소포로 인신 매매 중 엔도-lysosomal 경로를 통해 내용의 저하로 연결, 또는 세포의 뒤쪽 shuttled 아르 수 있습니다. 후자의 과정에서 1 내부 pH는 소포의 효소의 활동을위한 최적의 산도입니다 약 5-6로 산성화되는 등 라이소자임 등이 칸에서 기능 2. 최근 자료 수는 특별히이 산성화가 자신의화물 cytosolic 전달을 촉진하기 endosomes 활용하여 설계되었습니다. 이 방법의 한 예는 그의 핵심 physiologic pH를 (예 : 7.4)에서 zwitterionic 및 충전 중립입니다 합성, 고분자 마이셀의 나노 입자를 사용합니다. 그러나, 산도 6.0에서- 6.5, 고분자는 protonated이되고 마이셀 코어를 destabilizes 그물 긍정적 인 요금을 습득하고, 노출 된 폴리머 세그먼트과 상호 작용할 수 있으며 endosomal 멤브레인을 방해. 이 활동은 그들의 cytosolic 목표에 액세스 할 수 있습니다 펩타이드 및 핵산 기반 치료학의 endosomal 탈출을 홍보하기 위해 표시되었습니다. 막 장벽을 방해 endosomal 탈출을 중재하기 위해 개발 방법의 3,4 다른 예는 또는 &#39;fusogenic&#39;펩티드를 포함 인지질 이중층에 막 융합 또는 과도 기공 형성을 중재 할 수 있습니다 단백질이. 같은 폴리 (propylacrylic 산)와 같은 음이온 알킬 아크릴 산의 5 Homopolymers 또 다른 잘 공부 접근 방법이며, 이러한 고분자에 펜던트 카르 복실 산의 protonation 상태를 전환 해주는 엔도-lysosomal 산도 범위에서 소수성으로, 막 중단 상태입니다. 6,7 endosomolytic 행동을 검사에 대해 하나의 유용한 모델 시스템은 전자입니다X 생체의 산도에 의존 용혈 분석 8.이 모델 시스템에서, 적혈구 막에는 엔도-lysosomal 소포를 동봉 지질 이중층 막에 대한 대리 역할을합니다. 이 generalizable 모델이 세포 관통 펩티드 및 기타 고분자 유전자 전달 시스템의 endosomolytic 행동을 평가하는 다른 사용되었습니다. 8-11이 실험에서 인간의 적혈구와 테스트 자료는 모방 정의 PHS에서 버퍼에 공동 incubated 아르 세포 (7.4), 초 (6.8) endosomal, 그리고 엔도-lysosomal 하순 (&lt;6.8) 환경. 부화 기간 동안 출시 된 헤모글로빈의 양이 세제로 lysed 긍정적 인 제어 샘플에 출시 헤모글로빈의 양에 표준화되어 적혈구 용해의 측정으로 정량화되어 있습니다. 잠재적 endosomolytic 시험 자료의 작은 도서관을 심사에서, 하나는 산도 7.4에서 더 용혈을 생산하지 그 샘플을 추론하지만, 상당히 고농도의 헛기침 수산도 &lt;6.5에서 olysis은 cytosolic 약물 전달을위한 가장 효과적이고 cytocompatible 후보 될 것입니다. 이 기준에 맞는 자료를 무차별 엔도-lysosomal 구획에 국제화에 따라 지역의 pH의 감소에 노출되는 때까지 지질 이중층의 세포막 (세포 독성을 일으킬 수 IE)를 파괴 불활성이 아닌 상태로 유지 될 것으로 예상됩니다. 이 프로토콜에서는 적혈구는 인간의 기증자로부터 분리되며, 산도 5.6, 6.2, 6.8, 또는 실험 endosomolytic 약물 전달 에이전트와 7.4에서 공동 incubated. 그대로 적혈구는 pelleted 있으며, supernatants은 (lysed 적혈구에서 출시 헤모글로빈을 포함) 플레이트 리더 (그림 1)를 통해 헤모글로빈의 특성 흡광도를 분석하고 있습니다.

<table border="1"><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> BD Vacutainer - K2EDTA Vacutainer 튜브 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 22-253-145 </td><td> 혈액 수집을위한 </td></tr><tr><td> BD Vacutainer 혈액 수집 바늘, 20.5 게이지 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 02-665-31 </td><td> 혈액 수집을위한 </td></tr><tr><td> BD Vacutainer 튜브 홀더 / 니들 어댑터 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 22-289-953 </td><td> 혈액 수집을위한 </td></tr><tr><td> BD 브랜드 이소 프로필 알코올 스왑 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 13-680-63 </td><td> 혈액 수집을위한 </td></tr><tr><td> BD Vacutainer 라텍스 무료 지혈대 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 02-657-6 </td><td> 혈액 수집을위한 </TD&gt; </tr><tr><td> 염산 (conc.) </td><td> 피셔 과학 </td><td> A144-500 </td><td> D-PBS의 산도 조정하십시오. </td></tr><tr><td> 트리톤 X-100 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> T8787 </td><td> 긍정적 인 제어 </td></tr><tr><td> Dulbecco의 PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14,190 </td><td></td></tr><tr><td> SFCA 막과 Nalgene MF75 무균 일회용 병 - 상위 필터 단위 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 09-740 - 44A </td><td></td></tr><tr><td> BD 96 - 웰 플레이트, 평면 바닥, 조직 문화 처리 폴리스티렌 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 08-772 - 2C </td><td> 분석의 끝에서 판 읽기하십시오. </td></tr><tr><td> BD 96 - 웰 플레이트, 둥근 바닥, 조직 문화 처리 폴리스티렌 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 08-772-17 </td><td> 실험 대리인과 붉은 혈액 세포의 배양하십시오. </td></tr></표&gt;

ex vivo red blood cell hemolysis assay for the evaluation of ph-responsive endosomolytic agents for cytosolic delivery of biomacromolecular drugs

엔도-lysosomal 소포를 구성 인지질의 bilayers은 세포 내 표적에 대한 생물학적 약물의 전달에 장벽을 야기 할 수 있습니다. 이 장벽을 극복하기 위해, 합성 약물 캐리어의 수는 적극적으로 endosomal 멤브레인을 방해하고 세포질로화물을 제공하도록 설계되었습니다. 여기, 우리는 세포 내 약물 전달 시스템의 cytocompatibility 및 endosomolytic 활동에 대한 신속하고 높은 처리량 화면으로 사용할 수있는 용혈 분석을 설명합니다. 용혈 분석에서 인간의 적혈구와 테스트 자료는 세포, 초기 endosomal, 늦은 엔도-lysosomal 환경을 모방 정의 PHS의 버퍼의 Co-incubated 수 있습니다. 펠렛 그대로 적혈구에 원심 분리 단계 후, 매체에 발표 헤모글로빈의 양이 spectrophotometrically (가장 동적 범위 405 nm의) 측정됩니다. %의 적혈구 장애는 이후 긍정적 인 제어 samp에 상대적으로 정량화된다레 세제로 lysed. 이 모델 시스템에서 적혈구 막에는 엔도-lysosomal 소포를 동봉 지질 이중층 막에 대한 대리 역할을합니다. 원하는 결과는 physiologic pH를 (7.4) 약 산도 5-6.8에서 엔도-lysosomal 산도 범위에서 강력한 용혈에서 무시할 용혈 수 있습니다.

<html> 일반적으로 이상적인 산도에 의존 용혈성 문제가 발생할 요원이 마약, 핵산, 또는 다른 bioactive 분자의 cytosolic 제공을위한 최고의 잠재력을 갖추고 있습니다. 이것은 산도 7.4에서 최소한의 용혈을 전시하고 그림 2에 묘사로 에이전트 # 1 예시하지만, endosomal 산도 범위 (&lt;6.5)에서 용혈성 행동의 날카로운 증가하고 있습니다. 이러한 대리인이 hemocompatible되지 않을 수 있습니다 잠재...

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Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs

용혈 분석은 세포 내화물 배달 약물 전달 시스템 &#39;cytocompatibility과 endosomolytic 활동의 빠른, 높은 처리량 화면으로 사용할 수 있습니다. 검정은 환경 산도의 함수로 적혈구 멤브레인의 중단을 측정합니다.

Biomacromolecular 일반 의약품의 Cytosolic 전송 산도 - 응답 Endosomolytic 에이전트의 평가에 대한 예 VIVO 레드 블러드 세포 용혈 분석

Phospholipid bilayers that constitute endo-lysosomal vesicles can pose a barrier to delivery of biologic drugs to intracellular targets. To overcome this ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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연구

면역학 및 감염병학

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