Name: ex vivo red blood cell hemolysis assay for the evaluation of ph-responsive endosomolytic agents for cytosolic delivery of biomacromolecular drugs
Uploaded: 2013-03-09T14:00:00
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Los autores agradecen la financiación a través del Departamento de Defensa, el Congreso dirigió programas de Investigación Médica (# W81XWH-10-1-0445), los Institutos Nacionales de Salud (NIH R21 HL110056), y la American Heart Association (# 11SDG4890030).

1. Preparación y Esterilización de tampones y agentes de prueba <ol><li> 150 mM de tampón de NaCl: Disolver 4,383 g de cristales de NaCl en 500 ml de agua nanopura. </li><li> Tampones de pH: Preparar los tampones de fosfato a pH 5,6, 6,2, 6,8, y 7,4 mediante la mezcla de cantidades apropiadas de monobásico y fosfato sódico dibásico. Si las muestras se van a probar a valores de pH más bajos (es decir, pH &lt;5,6) y luego una amortiguación más apropiado, tal como tampón citrato, se debe utilizar. Rece...

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	<li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2002).</li><li>Boasson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Bacteriolysis+by+Lysozyme.">On the Bacteriolysis by Lysozyme.</a> The Journal of Immunology. 34, 281-293 (1938).</li><li>Convertine, A. J., Benoit, D. S., Duvall, C. L., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+endosomolytic+diblock+copolymer+for+siRNA+delivery.">Development of a novel endosomolytic diblock copolymer for siRNA delivery.</a> J. Control. Release. 133, 221-229 (2009).</li><li>Duvall, C. L., Convertine, A. J., Benoit, D. S., Hoffman, A. 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K., Labhasetwar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+endo-lysosomal+escape+of+poly(DL-lactide-co-glycolide)+nanoparticles:+implications+for+drug+and+gene+delivery.">Rapid endo-lysosomal escape of poly(DL-lactide-co-glycolide) nanoparticles: implications for drug and gene delivery.</a> The FASEB Journal. 16, 1217-1226 (2002).</li></ol>

sensibilidad al pH polímeros u otros agentes diseñados para la función endosomolítico puede ser rápida y eficaz detección basado en la lisis de las células rojas de la sangre a valores de pH encontradas en el endosoma (Figura 1; pH 6,8 - endosoma temprano, pH 6,2 - endosoma tardío, pH 5,6 - lisosoma). 14-17 dependiente del pH hemólisis se ha utilizado para cribar la capacidad de las compañías para mediar en la liberación endosomal de la terapéutica biomacromoleculares (por ej...

Aunque hay muchos potenciales de alto impacto dianas terapéuticas dentro de la célula, la administración intracelular de agentes plantea un desafío significativo. Con frecuencia, los fármacos, especialmente biológicos, son internalizados por las células a la trata en vesículas que o bien conducir a la degradación de su contenido a través de la vía endo-lisosomal, o son transportados de nuevo fuera de la célula a través de exocitosis. 1 En el último proceso, el pH interno de las vesículas se acidifica a aproximadamente 5-6, que es el pH óptimo para la actividad de las enzimas que funcionan en este compartimiento, tal como lisozima. 2 Recientemente, una serie de materiales han sido diseñados específicamente para aprovechar la acidificación de los endosomas para facilitar la entrega citosólica de su carga. Un ejemplo de este enfoque utiliza polímeros sintéticos, nanopartículas micelares cuyo núcleo es de ion híbrido y neutro de carga a pH fisiológico (es decir, 7,4). Sin embargo, a pH 6,0- 6,5, los polímeros a ser protonados y adquirir una carga positiva neta que desestabiliza el núcleo de la micela, y los segmentos de polímero expuestos interactuar con y alteran la membrana endosomal. Esta actividad se ha demostrado para promover el escape endosomal de péptidos y ácidos nucleicos basados ​​en ácido terapéutica, lo que les permite acceder a sus objetivos citosólicas. 3,4 Otros ejemplos de métodos desarrollados para mediar de escape endosomal que interrumpir la barrera de la membrana incluyen &#39;fusogénicos&#39; o péptidos proteínas que pueden mediar la fusión de membranas o la formación de poros transitorios en la bicapa de fosfolípidos. 5 homopolímeros de ácidos acrílicos aniónicos de alquilo tales como poli (ácido propilacrílico) son otro enfoque bien estudiado, y en estos polímeros, el estado de protonación de ácido carboxílico colgantes dicta transición en un hidrófobo, la membrana disruptiva de estado en intervalos de pH endo-lisosomales 6,7. Un sistema de modelo útil para el cribado de comportamiento endosomolítico es el correox dependiente del pH in vivo ensayo de hemólisis. 8 En este sistema modelo, la membrana de los eritrocitos sirve como un sustituto para la membrana de bicapa lipídica que encierra endo-lisosomales vesículas. Este modelo generalizable ha sido utilizado por otros, para evaluar el comportamiento de endosomolítico penetran en las células péptidos y otros sistemas poliméricos de liberación de genes. 8-11 En este experimento, las células rojas de la sangre y los materiales de ensayo se incuban conjuntamente en tampones a pH definidos que imitan extracelulares (7,4), a principios endosomal (6,8), y tarde endo-lisosomal (&lt;6,8) entornos. La cantidad de hemoglobina liberada durante el período de incubación se cuantificó como una medida de la lisis de glóbulos rojos, que se normaliza a la cantidad de hemoglobina liberada en muestras de control positivas lisadas con un detergente. A partir de la detección de una pequeña biblioteca de materiales de ensayo potencialmente endosomolítico, se puede inferir que las muestras que no producen hemólisis a un pH de 7,4, pero dobladillo significativamente elevadosolysis a pH &lt;6,5, serán los candidatos más eficaces y citocompatible para administración de fármacos citosólica. Los materiales que se ajusten a estos criterios se espera que permanezca inerte y no indiscriminadamente destruir las membranas de bicapa lipídica (es decir, que podría causar citotoxicidad) hasta ser expuesto a una caída en el pH local después de la internalización en endo-lisosomales compartimentos. En este protocolo, los eritrocitos se aíslan de un donante humano y co-incubadas a pH 5,6, 6,2, 6,8, o 7,4 con agentes experimentales endosomolítico de suministro de fármacos. Los eritrocitos intactos se sedimentan, y los sobrenadantes (que contiene la hemoglobina liberada a partir de eritrocitos lisados) se analizan para la absorbancia característica de la hemoglobina a través de un lector de placas (Figura 1).

<table border="1"><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> BD Vacutainer - K2EDTA tubos vacutainer </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-253-145 </td><td> Para la recolección de sangre </td></tr><tr><td> BD Vacutainer recolección de sangre, agujas de calibre 20,5 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-665-31 </td><td> Para la recolección de sangre </td></tr><tr><td> BD Vacutainer Tube soporte / adaptador de aguja </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-289-953 </td><td> Para la recolección de sangre </td></tr><tr><td> BD Marca Alcohol isopropílico Swabs </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-680-63 </td><td> Para la recolección de sangre </td></tr><tr><td> BD Vacutainer sin látex Tourniquet </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-657-6 </td><td> Para la recolección de sangre </td&gt; </tr><tr><td> El ácido clorhídrico (conc.) </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144-500 </td><td> Para el ajuste del pH de D-PBS. </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8787 </td><td> El control positivo </td></tr><tr><td> PBS de Dulbecco </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Nalgene estéril desechable MF75 Bottle-Top Unidad de filtro con membrana SFCA </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09 a 740-44A </td><td></td></tr><tr><td> BD placas de 96 pocillos, de fondo plano, de cultivo de tejidos tratados con poliestireno </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08 a 772-2C </td><td> Para la placa de lectura al final del ensayo. </td></tr><tr><td> BD placas de 96 pocillos, de fondo redondo, de cultivo de tejidos tratados con poliestireno </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772-17 </td><td> Para la incubación de las células rojas de la sangre con agentes experimentales. </td></tr></table&gt;

ex vivo red blood cell hemolysis assay for the evaluation of ph-responsive endosomolytic agents for cytosolic delivery of biomacromolecular drugs

Bicapas de fosfolípidos que constituyen endo-lisosomal vesículas pueden suponer un obstáculo para la entrega de medicamentos biológicos a los objetivos intracelulares. Para superar esta barrera, una serie de portadores de fármacos sintéticos han sido diseñados para interrumpir activamente la membrana endosomal y entregar la carga en el citoplasma. Aquí se describe el ensayo de hemólisis, que se puede utilizar como rápido y de alto rendimiento para la pantalla cytocompatibility y actividad endosomolítico intracelulares de sistemas de suministro de fármacos. En el ensayo de hemólisis, las células rojas de la sangre y los materiales de ensayo se incuban conjuntamente en tampones a pH definidos que imitan extracelulares, endosomal temprano y tardío endo-lisosomales entornos. Tras una etapa de centrifugación para sedimentar glóbulos rojos intactos, la cantidad de hemoglobina liberada en el medio se midió espectrofotométricamente (405 nm para el mejor rango dinámico). El porcentaje de glóbulos rojos interrupción se cuantifica en relación con el control positivo samples lisadas con un detergente. En este sistema de modelo de la membrana de los eritrocitos sirve como un sustituto para la membrana de bicapa lipídica que encierra endo-lisosomales vesículas. El resultado deseado es la hemólisis despreciable a pH fisiológico (7,4) y la hemólisis robusta en el intervalo de pH endo-lisosomal de aproximadamente pH 5-6.8.

<html> Típicamente, los agentes que exhiben ideales dependiente del pH comportamiento hemolítica tienen el mayor potencial para la entrega citosólica de fármacos, ácidos nucleicos, u otras moléculas bioactivas. Esto se ejemplifica por el Agente # 1 como se representa en la figura 2, que muestra la hemólisis mínima a un pH de 7,4, pero un fuerte aumento en el comportamiento hemolítica a intervalos de pH endosomal (&lt;6,5). Algunos agentes pueden mostrar niveles significativos de comportamiento h...

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Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs

Un ensayo de hemólisis se puede utilizar como una rápida, de alto rendimiento pantalla de cytocompatibility sistemas de administración de fármacos y la actividad endosomolítico para entrega de carga intracelular. El ensayo mide la disrupción de membranas de eritrocitos como una función del pH del medio ambiente.

Ex Vivo Blood Red Cell Hemólisis Ensayo para la Evaluación de pH sensibles a agentes endosomolítico para la entrega citosólica de Drogas biomacromoleculares

Phospholipid bilayers that constitute endo-lysosomal vesicles can pose a barrier to delivery of biologic drugs to intracellular targets. To overcome this ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

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HLA-Ig celdas en función de antígeno artificiales presentación para mejorar la eficiencia Ex vivo Ampliación de los Derechos Humanos CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Investigación

Inmunología e Infección

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La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

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