Name: isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine peyer's patches
Uploaded: 2013-03-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches at JoVE.com

نشكر رينجي الأغاني (ادسورث قياس التدفق الخلوي مركز كور) للمساعدة في تحليل الخلايا وهيلين جونسون (ادسورث مركز التشريح المرضي الأساسية الحيوان) لإعداد أقسام البارافين. نشكر الدكتور ريتشارد كول (ادسورث المجهر الضوئي مركز كور) للحصول على المساعدة مع المجهري متحد البؤر وجمع الصور. نود أن نعترف اندي بنتلي (ادسورث مركز الصور وتوضيحات) للحصول على المساعدة مع الرسوم المتحركة. ويدعم MDJ من قبل مؤسسة الحياة بحوث العلوم، معهد هوارد هيوز الطبي (HHMI) زمالة. ويدعم SA من زمالة مركز البحوث وادز ورث، وشركة صحة ما بعد الدكتوراه جماعية. وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح HD061916 وGM082978.

وتم إيواء الحيوانات تحت التقليدية وشروط محددة خالية من مسببات الأمراض وعولج في الامتثال الكامل لمركز رعاية الحيوان في ادسورث المؤسسية واستخدام المبادئ التوجيهية للجنة (IACUC). 1. عن طريق الفم بالتزقيم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style...

<ol>
	<li>Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+IgA's+complex+roles+in+immunity+and+mucosal+homeostasis+in+the+gut.">Secretory IgA's complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut.</a> Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).</li><li>Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaboration+of+epithelial+cells+with+organized+mucosal+lymphoid+tissue.">Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue.</a> Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).</li><li>Rescigno, M., Sabatino, A. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+intestinal+homeostasis+and+disease.">Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease.</a> J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).</li><li>Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GALT:+organization+and+dynamics+leading+to+IgA+synthesis.">GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis.</a> Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).</li><li>Iwasaki, A., Kelsall, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+distinct+Peyer's+patch+dendritic+cell+subsets+and+their+recruitment+by+chemokines+macrophage+inflammatory+protein+(MIP)-3alpha,+MIP-3beta,+and+secondary+lymphoid+organ+chemokine.">Localization of distinct Peyer's patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine.</a> Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).</li><li>Iwasaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+dendritic+cells.">Mucosal dendritic cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).</li><li>Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peyer's+Patch+Dendritic+Cells+Sample+Antigens+by+Extending+Dendrites+Through+M+Cell-Specific+Transcellular+Pores.">Peyer's Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores.</a> Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).</li><li>Lelouard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+bacteria+and+dead+cells+are+internalized+by+a+unique+subset+of+Peyer's+patch+dendritic+cells+that+express+lysozyme.">Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer's patch dendritic cells that express lysozyme.</a> Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).</li><li>Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+toxin+induces+migration+of+dendritic+cells+from+the+subepithelial+dome+region+to+T-+and+B-cell+areas+of+Peyer's+patches.">Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches.</a> Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).</li><li>Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+IgA+possesses+intrinsic+modulatory+properties+stimulating+mucosal+and+systemic+immune+responses.">Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses.</a> J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).</li><li>Kelsall, B. L., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+populations+of+dendritic+cells+are+present+in+the+subepithelial+dome+and+T+cell+regions+of+the+murine+Peyer's+patch.">Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer's patch.</a> J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).</li><li>Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+Mouse+Ligated+Peyer's+Patch+Intestinal+Loop+Assay+to+Evaluate+Bacterial+Uptake+by+M+cells.">Application of a Mouse Ligated Peyer's Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells.</a> J. Vis. Exp. (58), e3225 (2011).</li><li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Dendritic+Cells+and+Macrophages+from+the+Mouse+Intestine.">Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine.</a> J. Vis. Exp. (63), e4040 (2012).</li><li>Lopez-Guerrero, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotavirus+infection+activates+dendritic+cells+from+Peyer's+patches+in+adult+mice.">Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer's patches in adult mice.</a> J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).</li></ol>

في هذه المقالة، قدمنا ​​البروتوكولات موازية لإعداد التحضيرات PP خلية واحدة لتحليل تدفق cytometric والوظيفية وcryosections للالمناعية. كلتا الطريقتين هي استنساخه للغاية ويمكن الوصول إليها بسهولة، وفرت قياس التدفق الخلوي وناظم البرد المتاحة. وينبغي للمحققين مرة الأولى تجدر ا?...

بقع باير (PPS) هي المجاميع العيانية من بصيلات اللمفاوية المنظمة الحالية في جميع أنحاء الأمعاء الدقيقة للإنسان والفئران (الشكل 1) وتشكل المواقع الأساسية التي تم تهيئتها الاستجابات المناعية المخاطية ضد مستضدات الغذائية والبكتيريا المتعايشة، ومسببات الأمراض الميكروبية، واللقاحات عن طريق الفم 1-4. على عكس الأنسجة الأخرى اللمفاوية الطرفية مثل العقد الليمفاوية المساريقي، ذكر المكتب الصحفى تفتقر الأوعية اللمفاوية وارد. كما هي مدفوعة، مثل الاستجابات المناعية التكيفية في ذكر المكتب الصحفى ردا على مستضدات المستمدة من تجويف الأمعاء. ويتم إنجاز أخذ عينات من المستضدات لمعي من قبل ظهارة جريب المرتبطة (FAE)، الذي يتكون من كل من الخلايا المعوية ومستضد أخذ العينات المعروفة باسم الخلايا M. تحت FAE، في قبة شبه الظهارية (SED) المنطقة، وتقع شبكة من الخلايا الجذعية (DCS) تتداخل مع الضامة، والخلايا B، وCD4 + T الخلايا 5-9. في صميم كل follicl اللمفاوية PPه هي الخلايا الجذعية الجريبي (FDCS) وخلية الغنية المركزية B مركز جرثومي، ويحيط بها مناطق T بين الجريبات الخلية الغنية. أخذ العينات بواسطة المستضد النتائج ذكر المكتب الصحفى في تطوير خلية + B ايغا plasmablasts وCD4 + الخلايا المستجيب والذاكرة التي الصفيحة المخصوصة البذور المحيطة ومنح الحصانة لمجموعة واسعة من الغزاة المخاطية. تشريح الأحداث المناعية المعقدة المرتبطة مستضد أخذ العينات، وتجهيز، وعرض في ذكر المكتب الصحفى هو مهمة شاقة، بالنظر إلى أن خلايا PP لا تشكل سوى نسبة ضئيلة من الخلايا اللمفاوية في مجموع مخاطية الأمعاء. للمساعدة في توصيف في المختبر من خلايا في هذه البيئة، ونحن نقدم لإعداد بروتوكول مجموع الماوس خلايا PP لتحليل تدفق cytometric والوظيفية، وكذلك بروتوكول لإعداد PP cryosections المناعي للفحص المجهري وimmunohistology. لدينا بروتوكول لعزل وتوصيف، والمناعية من مذكرات التفاهمه خلايا PP ليست رواية في حد ذاتها، كما يتضح من حقيقة أن هناك إشارات عديدة يعود تاريخها إلى أكثر من 25 عاما أن أذكر هذه التقنيات 5،6،9-11. بدلا من ذلك، لدينا بروتوكول يوفر مبسطة (والبصرية) للمحققين طريقة جمع ذكر المكتب الصحفى للمرة الأولى. ويتقن تقنيات بسهولة وصفنا وتسفر بسهولة أعداد كبيرة من الخلايا مع&gt; بقاء الخلية 90٪. بروتوكول cryosectioning ينتج المسلسل أقسام استنساخه للغاية مثاليا للتلوين المناعي والتصوير مبائر. وعلاوة على ذلك، لدينا بروتوكول يكمل الأخريين إن الرب المقالات الأخيرة. الأولى، من قبل فوكودا والزملاء، يصف استخدام المقايسات ligated حلقة اللفائفية لتقييم امتصاص البكتيريا المسببة للأمراض من قبل خلايا M PP 12. الآخر، من خلال Geem والزملاء، ويصف العزلة وتوصيف البلدان النامية والضامة من الغشاء المخاطي المعوي الماوس، لكنه يستثني صراحة من ذكر المكتب الصحفى تحليل ال 13.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> بند </td><td> شركة </td><td> القط. # </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> مجمع أكتوبر </td><td> الأنسجة تيك </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 7x7x5 ملم قاعدة قوالب </td><td> Fisherbrand </td><td> 22-363-552 </td><td></td></tr><tr><td> ImmEdge القلم </td><td> ناقلات مختبرات </td><td> H-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost زائد الشرائح </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 4951 </td><td></td></tr><tr><td> حافة شفرة شعيرة </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 4280L </td><td></td></tr><tr><td> المضادة للماوس CD11c-PE </td><td> eBioscience </td><td> 17-0114-82</td><td></td></tr><tr><td> المضادة للماوس CD45R/B220-APC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553092 </td><td></td></tr><tr><td> المضادة للماوس CD3-FITC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 561798 </td><td></td></tr><tr><td> المضادة للماوس CD4-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553652 </td><td></td></tr><tr><td> المضادة للماوس CD8-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553032 </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة CD19-الماوس PercP </td><td> BioLegend </td><td> 115531 </td><td></td></tr><tr><td> هانك حل متوازن الملح (HBSS) دون الحمراء الفينول </td><td> فيشر العلمية </td><td> 14175-079 </td><td></td></tr><tr><td> 70 ميكرومتر مصفاة الخلية </td><td> BD الصقر </td><tد&gt; 352350 </td><td></td></tr><tr><td> الطحال التفكك متوسطة </td><td> وقف تقنيات الخليوي </td><td> 7915 </td><td></td></tr><tr><td> مصل الماعز </td><td> إينفيتروجن </td><td> 16210-072 </td><td></td></tr><tr><td> FC بلوك </td><td> ATCC 2.4.G2 </td><td> HB-197 </td><td> Supes تم الحصول عليها من خط الخلية 2.4.G2 </td></tr><tr><td> منحني مقص </td><td> FST </td><td> 14061-09 </td><td></td></tr><tr><td> ناظم البرد </td><td> لايكا </td><td> 3050S </td><td></td></tr><tr><td> FACS Calibur </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> الكونتيسة خلية مكافحة </td><td> إينفيتروجن </td><td></td><td></td></tr><tr><td> الهيماتوكسيلين </td&gt; <td> ريتشارد ألان </td><td> 7211 </td><td></td></tr><tr><td> يوزين </td><td> ريتشارد ألان </td><td> 71304 </td><td></td></tr><tr><td> الفورمالين محلول مائي </td><td> Starplex العلمية </td><td> 3661 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الجدول 1. الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة. </td></tr></tbody></table>

isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine peyer's patches

بقع باير (PPS) جزءا لا يتجزأ من أنسجة الأمعاء المرتبطة اللمفاوية (GALT) ولعب دورا محوريا في الأمعاء والترصد المناعي التوازن. يتم أخذ عينات باستمرار مستضدات الجسيمات والجراثيم في لمعة الأمعاء من قبل خلايا M PP في ظهارة جريب المرتبطة (FAE) ونقلها إلى شبكة الكامنة وراء الخلايا الجذعية (DCS)، الضامة، والخلايا الليمفاوية. في هذه المقالة، ونحن تصف بروتوكولات التي هي ذكر المكتب الصحفى الفئران (ط) فصل في تعليق خلية واحدة وتعرض لالتدفق الخلوي و (الثاني) والتي أعدت للcryosectioning المناعية. لالتدفق الخلوي، ذكر المكتب الصحفى لفصل ميكانيكيا ثم يصفى من خلال 70 ميكرومتر الأغشية لتوليد تعليق خلية واحدة خالية من الخلايا الظهارية والحطام الكبيرة. بدءا من 20-25 ذكر المكتب الصحفى (من أربعة الفئران)، وهذه الطريقة سريعة وقابلة للتكرار غلة يبلغ عدد سكانها&gt; 2.5 × 10 6 خلايا مع&gt; بقاء الخلية 90٪. لجديدة، cryosectioningذكر المكتب الصحفى لاي مغمورة معزولة في قطع الأمثل المتوسطة (OCT) درجة الحرارة، الأداة الإضافية المجمدة في النيتروجين السائل، ثم مقطوع باستخدام cryomicrotome. أقسام الأنسجة (5-12 ميكرون) هي الهواء المجفف، ثابتة مع الأسيتون أو الميثانول، وثم تعرض لimmunolabeling.

تحليل تدفق cytometric من المعلقات monodisperse من الخلايا PP مجموع يكشف عن تمييز واضح بين استعدادات جيدة الخلية والفقراء. في الخلية الاستعدادات جيدة مع بقاء أكثر من 80٪، فإن الغالبية العظمى من الخلايا إظهار مبعثر إلى الأمام عالية (FSC)، وهو مؤشر على حجم الخلايا عالية، وانخفاض مبعث?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches at JoVE.com

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

هناك اهتمام متزايد في فهم وظائف مناعية المجموعات السكانية الفرعية معينة من الخلايا في بقع باير (PPS)، والمواقع الأساسية استقرائي من الأنسجة اللمفاوية الأمعاء المرتبطة. نحن هنا الخطوط العريضة لإعداد بروتوكولات موازية PP الاستعدادات خلية واحدة لتحليل تدفق cytometric وcryosections PP لالمناعية.

عزل والخلايا اللمفاوية المناعية والخلايا الجذعية من الفئران باير لالرقع

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

جيل ووسمها الفئران خلايا نخاع العظام المستمدة من البلورات النانوية مع شجيري Qdot تتبع للدراسات

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

عزل وتوصيف الخلايا الجذعية والضامة من الأمعاء ماوس

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

عزل الخلايا الجذعية متعلق بالنخاع الشوكي والخلايا الظهارية من الغدة الصعترية الإنسان

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

تقييم تطوير خلايا الفئران الجذعية بلازماوية في بقع باير طريق نقل بالتبني من أسلاف المكونة للدم

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

T خلايا التقاط البكتيريا التي كتبها Transinfection من الخلايا الجذعية

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

في المختبر جيل من الخلايا الجذعية من الفئران بلازماوية الشكل المشتركة اللمفاوية الأسلاف باستخدام نظام تغذية AC-6

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

العزلة وتدفق Cytometric توصيف الفئران الصغيرة المعوية اللمفاويات

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

العزلة وتنشيط الخلايا الليمفاوية الفئران

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

جيل من الوحيدات المستمدة الخلايا الجذعية البشرية من الدم الكامل

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

عزل الخلايا الليمفاوية من الماوس صغيرة المعوية المناعي

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...