Name: isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine peyer's patches
Uploaded: 2013-03-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches at JoVE.com

Wij danken Renjie Song (Wadsworth Center Flowcytometrie Core) voor hulp bij het cel-analyse en Helen Johnson (Wadsworth Center Animal histopathologie Core) voor de bereiding van paraffine secties. Wij danken dr. Richard A. Cole (Wadsworth Center Licht Microscopy Core) voor hulp bij confocale microscopie en fotocollectie. We willen graag Andy Bentley (Wadsworth Foto en Illustratie) erkennen voor hulp met animaties. MDJ wordt ondersteund door de Life Sciences Research Foundation, Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Fellowship. SA wordt ondersteund door een Wadsworth Center-Health Research Inc intramurale postdoctoraal fellowship. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH subsidie ​​HD061916 en GM082978.

De dieren werden gehuisvest onder conventionele, specifieke pathogeen-vrije omstandigheden en werden behandeld in volledige overeenstemming met Institutionele Animal Care het Wadsworth Center en gebruik Comite (IACUC) richtlijnen. 1. Orale sondevoeding <ol><li> (Optioneel) Gavage muizenstam van keuze met een antigeen of microben van belang met behulp van een 22 G x 1,5-in. blunt-end voeding naald (Popper Scientific, New Hyde Park, NY). Levering volumes mag niet meer dan 400 ul per muis. </...

<ol>
	<li>Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+IgA's+complex+roles+in+immunity+and+mucosal+homeostasis+in+the+gut.">Secretory IgA's complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut.</a> Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).</li><li>Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaboration+of+epithelial+cells+with+organized+mucosal+lymphoid+tissue.">Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue.</a> Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).</li><li>Rescigno, M., Sabatino, A. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+intestinal+homeostasis+and+disease.">Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease.</a> J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).</li><li>Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GALT:+organization+and+dynamics+leading+to+IgA+synthesis.">GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis.</a> Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).</li><li>Iwasaki, A., Kelsall, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+distinct+Peyer's+patch+dendritic+cell+subsets+and+their+recruitment+by+chemokines+macrophage+inflammatory+protein+(MIP)-3alpha,+MIP-3beta,+and+secondary+lymphoid+organ+chemokine.">Localization of distinct Peyer's patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine.</a> Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).</li><li>Iwasaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+dendritic+cells.">Mucosal dendritic cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).</li><li>Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peyer's+Patch+Dendritic+Cells+Sample+Antigens+by+Extending+Dendrites+Through+M+Cell-Specific+Transcellular+Pores.">Peyer's Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores.</a> Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).</li><li>Lelouard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+bacteria+and+dead+cells+are+internalized+by+a+unique+subset+of+Peyer's+patch+dendritic+cells+that+express+lysozyme.">Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer's patch dendritic cells that express lysozyme.</a> Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).</li><li>Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+toxin+induces+migration+of+dendritic+cells+from+the+subepithelial+dome+region+to+T-+and+B-cell+areas+of+Peyer's+patches.">Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches.</a> Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).</li><li>Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+IgA+possesses+intrinsic+modulatory+properties+stimulating+mucosal+and+systemic+immune+responses.">Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses.</a> J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).</li><li>Kelsall, B. L., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+populations+of+dendritic+cells+are+present+in+the+subepithelial+dome+and+T+cell+regions+of+the+murine+Peyer's+patch.">Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer's patch.</a> J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).</li><li>Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+Mouse+Ligated+Peyer's+Patch+Intestinal+Loop+Assay+to+Evaluate+Bacterial+Uptake+by+M+cells.">Application of a Mouse Ligated Peyer's Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells.</a> J. Vis. Exp. (58), e3225 (2011).</li><li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Dendritic+Cells+and+Macrophages+from+the+Mouse+Intestine.">Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine.</a> J. Vis. Exp. (63), e4040 (2012).</li><li>Lopez-Guerrero, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotavirus+infection+activates+dendritic+cells+from+Peyer's+patches+in+adult+mice.">Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer's patches in adult mice.</a> J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).</li></ol>

In dit artikel, hebben we parallel protocollen voor de voorbereiding van PP enkele cel voorbereidingen voor flowcytometrische en functionele analyse en vriescoupes voor immunokleuring. Beide methoden zijn zeer reproduceerbaar en gemakkelijk toegankelijke, ontvangen een flowcytometer en cryostaat zijn. Voor de eerste keer onderzoekers moet worden opgemerkt dat in vergelijking met de milt, totale cel opbrengsten van PP&#39;s zijn relatief gering. Niettemin, het protocol schetsen we het algemeen rendementen tussen 0,8-1,2 ...

Peyer&#39;s Patches (PP) zijn macroscopische aggregaten georganiseerde lymfoïde follikels aanwezig in de dunne darm van mensen en muizen (figuur 1) en het primaire plaatsen waar mucosale immuunresponsen ingeleid dieet antigenen, commensale bacteriën, pathogene micro-organismen en orale vaccins 1-4. In tegenstelling tot andere perifere lymfoïde weefsels zoals de mesenteriale lymfeklieren, PPs missen afferente lymfevaten. Als zodanig adaptieve immuunreacties in PP worden aangedreven in reactie op antigenen uit het darmkanaal. De bemonstering van luminale antigenen wordt uitgevoerd door het de follikel-geassocieerde epitheel (FAE), die bestaat uit zowel enterocyten en antigen-sampling cellen bekend als M cellen. Onder de FAE, in de sub-epitheliale dome (SED) gebied, ligt een netwerk van dendritische cellen (DCs) vermengd met macrofagen, B-cellen en CD4 + T-cellen 5-9. Aan de basis van elk PP lymfoïde follicle zijn folliculaire dendritische cellen (FDC) en een B cel-rijk centrale kiemcentrum, geflankeerd door T cellenrijke interfolliculaire zones. Antigen bemonstering door PP resulteert in de ontwikkeling van IgA + B cel plasmablasten en CD4 + effector en geheugencellen dat zaad de omringende lamina propria en bieden weerstand tegen een breed scala aan mucosale indringers. Opheldering van de complexe immunologische afspraken verbonden aan antigeen sampling, verwerking en presentatie in PP&#39;s is een moeilijke taak, gezien het feit dat PP cellen slechts een fractie van de totale lymfoïde cellen in het darmslijmvlies vormen. Om in de steun in vitro karakterisatie van cellen in deze omgeving, bieden wij een protocol voor het bereiden van het totaal muis PP cellen voor flowcytometrische en functionele analyse, evenals een protocol voor de bereiding PP cryocoupes voor immunofluorescentie microscopie en immunohistologie. Ons protocol voor de isolatie, karakterisering, en immunokleuring van mouse PP cellen is niet nieuw op zich, zoals blijkt uit het feit dat er tal van verwijzingen dateren van meer dan 25 jaar dat noemen deze technieken 5,6,9-11. Integendeel, ons protocol biedt een gestroomlijnde (en visuele) methode voor onderzoekers verzamelen PPs voor de eerste keer. De technieken beschrijven we gemakkelijk beheerst en gemakkelijk grote aantallen cellen leveren met&gt; 90% levensvatbaarheid van de cellen. De cryosectioning protocol levert zeer reproduceerbare seriecoupes ideaal voor immunofluorescentiekleuring en confocale beeldvorming. Verder is onze protocol vormt een aanvulling op twee andere recente Jove artikelen. De eerste door Fukuda en collega&#39;s beschrijven het gebruik van geligeerde ileal loop assays om de verspreiding van pathogene bacteriën te beoordelen door PP M cellen 12. De andere, door Geem en collega&#39;s, beschrijft de isolatie en karakterisering van DCs en macrofagen van de muis darmslijmvlies, maar uitdrukkelijk uitgesloten PP&#39;s uit hun analyse 13.

<table border="1"><tbody><tr><td> Item </td><td> Vennootschap </td><td> Cat. # </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> Oktober Compound </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 7x7x5 mm Base Molds </td><td> Fisherbrand </td><td> 22-363-552 </td><td></td></tr><tr><td> ImmEdge Pen </td><td> Vector Labs </td><td> H-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost Plus Slides </td><td> Thermo Scientific </td><td> 4951 </td><td></td></tr><tr><td> Edge Rite Blade </td><td> Thermo Scientific </td><td> 4280L </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mouse CD11c-PE </td><td> eBioscience </td><td> 17-0114-82</td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mouse CD45R/B220-APC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553092 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mouse CD3-FITC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 561798 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mouse CD4-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553652 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mouse CD8-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553032 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-muis CD19-PerCP </td><td> BioLegend </td><td> 115531 </td><td></td></tr><tr><td> Balanced salt Hank&#39;s oplossing (HBSS) zonder fenolrood </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14175-079 </td><td></td></tr><tr><td> 70 urn celzeef </td><td> BD Falcon </td><td&gt; 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Spleen Dissociatie Medium </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 7915 </td><td></td></tr><tr><td> Geitenserum </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-072 </td><td></td></tr><tr><td> Fc blokkeren </td><td> ATCC 2.4.G2 </td><td> HB-197 </td><td> Supes verkregen uit cellijn 2.4.G2 </td></tr><tr><td> Gebogen Schaar </td><td> FST </td><td> 14.061-09 </td><td></td></tr><tr><td> Cryostaat </td><td> Leica </td><td> 3050S </td><td></td></tr><tr><td> FACS Calibur </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gravin Cell Counter </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hematoxylin </td&gt; <td> Richard Allan </td><td> 7211 </td><td></td></tr><tr><td> Eosine </td><td> Richard Allan </td><td> 71304 </td><td></td></tr><tr><td> Formaline </td><td> Starplex Wetenschappelijke </td><td> 3661 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabel 1. Reagentia en apparatuur die in deze studie. </td></tr></tbody></table>

isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine peyer's patches

Plaques van Peyer (PP) zijn integrale componenten van het darm-geassocieerd lymfeweefsel (GALT) en spelen een centrale rol in de darm immunosurveillance en homeostase. Particulate antigenen en microben in het darmlumen worden continu bemonsterd door PP M cellen in de follikel-geassocieerde epitheel (FAE) en naar een onderliggende netwerk van dendritische cellen (DCs), macrofagen en lymfocyten. In dit artikel beschrijven we protocollen die zijn murine PP (i) gedissocieerd in enkele celsuspensies en onderworpen aan flowcytometrie en (ii) bereid voor cryosectioning en immunokleuring. Voor flowcytometrie, PPs mechanisch gedissocieerd en daarna gefiltreerd door membranen 70 urn tot enkele celsuspensies zonder epitheelcellen en grof vuil genereren. Beginnen met 20-25 PP (van vier muizen), deze snelle en reproduceerbare methode levert een populatie van&gt; 2,5 x 10 6 cellen met&gt; 90% levensvatbaarheid van de cellen. Voor cryosectioning, versely geïsoleerde PP worden ondergedompeld in Optimale Cutting Temperatuur (LGO) medium, snap-ingevroren in vloeibare stikstof, en dan coupes met behulp van een cryomicrotoom. Weefselcoupes (5-12 um) de lucht gedroogd, gefixeerd met aceton of methanol, en vervolgens onderworpen aan immunokleuring.

Flowcytometrische analyse van monodisperse suspensies van het totaal PP cellen blijkt dat er een duidelijk onderscheid tussen goede en slechte celpreparaten. In goede celpreparaten met meer dan 80% levensvatbaarheid, de overgrote meerderheid van de cellen aan te tonen een hoge voorwaartse verstrooiing (FSC), een indicator van hoge celvolume, en lage zijwaartse verstrooiing (SSC), een indicator van lage cel granulariteit (Figuur 2A). In dit experiment ook opzettelijk heeft een &quot;arme celpreparaat&quo...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches at JoVE.com

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Er is een toenemende belangstelling voor het begrijpen van de immunologische functies van specifieke subpopulaties van cellen in platen van Peyer (PP), de primaire inductieve plaatsen van darm-geassocieerd lymfeweefsel. Hier schetsen we parallel protocollen voor de voorbereiding van PP enkele cel voorbereidingen voor flowcytometrische analyse en PP cryocoupes voor immunokleuring.

Isoleren En Immunokleuring Lymfocyten en dendritische cellen uit Patches Murine Peyer

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Generatie en etikettering van Muriene Bone Marrow-afgeleide dendritische cellen met Qdot Nanokristallen voor Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Isolatie en karakterisering van dendritische cellen en macrofagen van de muis Darm

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolatie van myeloïde dendritische cellen en epitheelcellen van Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Het beoordelen van de ontwikkeling van de Muriene plasmacytoïde dendritische cellen in Peyer&#39;s Patches Met behulp adoptieve overdracht van hematopoëtische voorlopers

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

T-cellen Capture Bacteriën door Transinfection van dendritische cellen

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In vitro generatie van Muriene plasmacytoïde dendritische cellen van Common Lymfoïde Progenitors met behulp van de AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Isolatie en Flowcytometrische karakterisatie van muizen dunne darm lymfocyten

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

Isolatie en Activering van Muizen lymfocyten

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Genereren van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen uit volbloed

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isoleren van lymfocyten van het immuunsysteem intestinale kleine muis

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...