Name: isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine peyer's patches
Uploaded: 2013-03-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches at JoVE.com

אנו מודים שיר Renjie (Core cytometry זרימת מרכז Wadsworth) לקבלת סיוע בניתוח תא והלן ג&#39;ונסון (Wadsworth מרכז בעלי חי היסטופתולוגיה Core) להכנת קטעי פרפין. אנו מודים לד&quot;ר ריצ&#39;רד א קול (Core המיקרוסקופי אור מרכז Wadsworth) לקבלת סיוע במיקרוסקופיה confocal ואוסף תמונה. ברצוננו להודות אנדי נטלי (צילום Wadsworth מרכז ואיור) לקבלת סיוע עם אנימציות. MDJ נתמך על ידי קרן מחקר מדעי החיים, הווארד יוז רפואי במכון (HHMI) מלגה. SA נתמך על ידי מלגת Wadsworth מרכז-בריאות מחקר בע&quot;מ הבתר ביצוע עצמית. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענקי NIH HD061916 וGM082978.

בעלי חיים שוכנו בתנאים קונבנציונליים, ספציפיים לפתוגן חופשיים וטופלו בהתאמה מלאה לטיפולו של מרכז Wadsworth המוסדי בעלי החיים ושימוש הנחיות ועדה (IACUC). 1. Gavage האוראלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) עומס Gava...

<ol>
	<li>Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+IgA's+complex+roles+in+immunity+and+mucosal+homeostasis+in+the+gut.">Secretory IgA's complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut.</a> Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).</li><li>Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaboration+of+epithelial+cells+with+organized+mucosal+lymphoid+tissue.">Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue.</a> Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).</li><li>Rescigno, M., Sabatino, A. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+intestinal+homeostasis+and+disease.">Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease.</a> J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).</li><li>Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GALT:+organization+and+dynamics+leading+to+IgA+synthesis.">GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis.</a> Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).</li><li>Iwasaki, A., Kelsall, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+distinct+Peyer's+patch+dendritic+cell+subsets+and+their+recruitment+by+chemokines+macrophage+inflammatory+protein+(MIP)-3alpha,+MIP-3beta,+and+secondary+lymphoid+organ+chemokine.">Localization of distinct Peyer's patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine.</a> Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).</li><li>Iwasaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+dendritic+cells.">Mucosal dendritic cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).</li><li>Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peyer's+Patch+Dendritic+Cells+Sample+Antigens+by+Extending+Dendrites+Through+M+Cell-Specific+Transcellular+Pores.">Peyer's Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores.</a> Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).</li><li>Lelouard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+bacteria+and+dead+cells+are+internalized+by+a+unique+subset+of+Peyer's+patch+dendritic+cells+that+express+lysozyme.">Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer's patch dendritic cells that express lysozyme.</a> Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).</li><li>Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+toxin+induces+migration+of+dendritic+cells+from+the+subepithelial+dome+region+to+T-+and+B-cell+areas+of+Peyer's+patches.">Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches.</a> Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).</li><li>Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+IgA+possesses+intrinsic+modulatory+properties+stimulating+mucosal+and+systemic+immune+responses.">Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses.</a> J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).</li><li>Kelsall, B. L., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+populations+of+dendritic+cells+are+present+in+the+subepithelial+dome+and+T+cell+regions+of+the+murine+Peyer's+patch.">Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer's patch.</a> J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).</li><li>Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+Mouse+Ligated+Peyer's+Patch+Intestinal+Loop+Assay+to+Evaluate+Bacterial+Uptake+by+M+cells.">Application of a Mouse Ligated Peyer's Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells.</a> J. Vis. Exp. (58), e3225 (2011).</li><li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Dendritic+Cells+and+Macrophages+from+the+Mouse+Intestine.">Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine.</a> J. Vis. Exp. (63), e4040 (2012).</li><li>Lopez-Guerrero, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotavirus+infection+activates+dendritic+cells+from+Peyer's+patches+in+adult+mice.">Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer's patches in adult mice.</a> J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).</li></ol>

במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקולים מקבילים להכנת PP הכנות תא בודדות לזרימת ניתוח וcryosections cytometric ופונקציונלי לimmunostaining. שני שיטות לשחזור ומאוד נגישים, ובלבד cytometer זרימה וcryostat זמינים. לחוקרים בפעם הראשונה אותו יש לציין כי בהשוואה לטחול, תשואות סלולריות הכוללות מPPS הן דלות יח...

הטלאים של Peyer (PPS) הם אגרגטים מאקרוסקופיות של זקיקי הלימפה מאורגנים נוכחיים לאורך המעי הדק של בני אדם ועכברים (איור 1), ומהווים את האתרים העיקריים שבו תגובה חיסונית ברירית הם יזמו נגד אנטיגנים תזונתיים, חיידקי commensal, פתוגנים של חיידקים, וחיסונים דרך פה 1-4. בניגוד לרקמות הלימפה היקפיות אחרות כגון הבלוטות הלימפה mesenteric, PPS חסר lymphatics הביא. כאמורות, תגובות חיסוניות בהסתגלות PPS מונעות בתגובה לאנטיגנים הנגזרים מלומן המעי. הדגימה של אנטיגנים luminal מושגת על ידי האפיתל זקיק המשויך (Fae), אשר מורכב משני enterocytes ותאי אנטיגן דגימה הידועים כתאי M. מתחת Fae, באזור הכיפה תת אפיתל (SED), נמצאת רשת של תאים דנדריטים (DCS) מתערבים עם מקרופאגים, תאי B, ותאי T מסוג CD4 + 5-9. במרכזו של כל אחד follicl ימפואידית PPדואר הם תאי דנדריטים זקיקים (FDCs) ומרכז התא B עשיר מרכזי נבטי, מוקף באזורים עשירים בinterfollicular תא T. דגימת האנטיגן ע&quot;י תוצאות PPS בפיתוח + plasmablasts IgA B הסלולרי ותאי CD4 + מפעיל וזיכרון שזרע propria lamina הסביבה ולספק חסינות למגוון רחב לפולשים ריריים. לנתח את האירועים החיסוניים המורכבים הקשורים לאנטיגן דגימה, עיבוד, והצגה בPPS הוא משימה מרתיעה, בהתחשב בעובדה שתאי PP מהווים רק חלק זעיר מכלל תאי הלימפה ברירית מעי. כדי לסייע באפיון במבחנה של תאים בסביבה זו, אנו מספקים פרוטוקול להכנה כלל תאי PP עכבר לזרימת ניתוח cytometric ופונקציונלי, כמו גם פרוטוקול להכנת PP cryosections למיקרוסקופיה וimmunohistology immunofluorescence. הפרוטוקול שלנו לבידוד, אפיון, וimmunostaining של mousדואר תאי PP הוא לא רומן כשלעצמה, כפי שמעיד עובדה שיש אזכורים רבים שראשיתה יותר מ 25 שנים המצטטים את הטכניקות הללו 5,6,9-11. במקום זאת, הפרוטוקול שלנו מספק שיטה יעילה (ויזואלי) לחוקרי איסוף PPS בפעם הראשונה. את הטכניקות שבם הן שולט בקלות וללא קושי תנבנה מספר גדול של תאים עם&gt; 90% כדאיויות תא. פרוטוקול cryosectioning מניב חלקים סדרתיים לשעתקו מאוד אידיאלי המתאימים מכתימה immunofluorescence והדמית confocal. יתר על כן, הפרוטוקול שלנו משלים את שני מאמרים יופיטר אחרונים אחרים. הראשון, על ידי פוקודה ועמיתיו, מתאר את השימוש במבחני הלולאה ileal גבעול להעריך את הספיגה של חיידקים פתוגניים על ידי תאי PP M 12. השני, על ידי Geem ועמיתיו, מתאר את הבידוד והאפיון של DCS ומקרופגים מרירית מעי העכבר, אך אינו כולל באופן מפורש PPS מהניתוח שלהם 13.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פריט </td><td> חברה </td><td> חתול. # </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> מתחם אוקטובר </td><td> רקמה-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 7x7x5 תבניות בסיס מ&quot;מ </td><td> Fisherbrand </td><td> 22-363-552 </td><td></td></tr><tr><td> ImmEdge עט </td><td> מעבדות וקטור </td><td> H-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost פלוס שקופיות </td><td> Thermo Scientific </td><td> 4951 </td><td></td></tr><tr><td> אדג&#39; Rite Blade </td><td> Thermo Scientific </td><td> 4280L </td><td></td></tr><tr><td> אנטי עכבר CD11c-PE </td><td> eBioscience </td><td> 17-0114-82</td><td></td></tr><tr><td> אנטי עכבר CD45R/B220-APC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553092 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD3 מאוס-FITC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 561798 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי עכבר CD4-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553652 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי עכבר CD8-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553032 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD19 מאוס-PercP </td><td> BioLegend </td><td> 115531 </td><td></td></tr><tr><td> הפתרון של האנק המלח המאוזן (HBSS) בלי אדום פנול </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 14175-079 </td><td></td></tr><tr><td> מסננת תא 70 מיקרומטר </td><td> BD פלקון </td><tד&gt; 352350 </td><td></td></tr><tr><td> בינוני דיסוציאציה טחול </td><td> טכנולוגיות תאי גזע </td><td> 7915 </td><td></td></tr><tr><td> סרום עיזים </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-072 </td><td></td></tr><tr><td> Fc בלוק </td><td> ATCC 2.4.G2 </td><td> HB-197 </td><td> מפקחים מתקבלים מ2.4.G2 שורת התאים </td></tr><tr><td> מספריים מעוגלים </td><td> FST </td><td> 14061-09 </td><td></td></tr><tr><td> Cryostat </td><td> ליקה </td><td> 3050S </td><td></td></tr><tr><td> FACS Calibur </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> דלפק סלולרי רוזנת </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hematoxylin </td&gt; <td> ריצ&#39;רד אלן </td><td> 7211 </td><td></td></tr><tr><td> Eosin </td><td> ריצ&#39;רד אלן </td><td> 71304 </td><td></td></tr><tr><td> פורמלין </td><td> Starplex מדעי </td><td> 3661 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> טבלת 1. ריאגנטים וציוד המשמשים במחקר זה. </td></tr></tbody></table>

isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine peyer's patches

הטלאים של Peyer (PPS) הם רכיבים בלתי נפרדים מרקמות הלימפה מעיים הקשורים (גאלט) ולשחק תפקיד מרכזי בimmunosurveillance והומאוסטזיס מעיים. אנטיגנים חלקיקים וחיידקים בחלל המעי נדגמים ברציפות על ידי תאי PP ז אפיתל זקיק המשויך (Fae) והועברו לרשת בסיסית של תאים דנדריטים (DCS), מקרופאגים ולימפוציטים. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקולים בי PPS Murine הם (אני) ניתק להשעיות תא בודדות ונתון לcytometry הזרימה (ii) שהוכן עבור cryosectioning וimmunostaining. עבור cytometry זרימה, PPS הם מכאני ניתק ולאחר מכן מסונן דרך 70 מיקרומטר ממברנות ליצור השעיות תא בודדות ללא תאי אפיתל ופסולת גדולים. החל עם 20-25 PPS (מארבעה עכברים), שיטה מהירה ולשעתק זו מניבה אוכלוסייה&gt; 2.5 x 10 6 תאים עם&gt; 90% כדאיויות תא. לcryosectioning, טריPPS ly המבודד שקוע בטמפרטורה בינונית אופטימלי חיתוך (אוקטובר), Snap-קפוא בחנקן נוזלי, ולאחר מכן נותח באמצעות cryomicrotome. קטעי רקמה (5-12 מיקרומטר) הם אוויר יבשים, קבועים עם אצטון או מתנול, ולאחר מכן נתונים לimmunolabeling.

ניתוח cytometric זרימת השעיות monodisperse של תאי PP כלל מגלה הבחנה ברורה בין הכנות סלולריות טובות וגרועות. בהכנות סלולריות טובות עם מעל 80% כדאיות, הרוב המכריע של תאים להדגים פיזור גבוה קדימה (FSC), חיווי של נפח תא גבוה, ופיזור נמוך צד (SSC), חיווי של גרעיניות נמוכה של תאים (איור 2 א)...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches at JoVE.com

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

יש התעניינות הולכת וגובר בהבנת הפונקציות החיסוניות של אוכלוסיות מסוימות של תאים בתיקונים של Peyer (PPS), אתרים אינדוקטיביים העיקריים של רקמות הלימפה מעיים כרוכות בכך. כאן אנו מתארים פרוטוקולים מקבילים להכנת PP הכנות תא בודדות לניתוח cytometric זרימה וcryosections PP לimmunostaining.

וגם בידוד Immunostaining ימפוציטים ותאי דנדריטים מהתיקונים של Peyer Murine

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

הדור וסימון של Murine מח עצם הנגזרות תאים דנדריטים עם nanocrystals Qdot ללימודי מעקב

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

בידוד ואיפיון של תאים דנדריטים ומקרופגים מהמעי עכבר

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

בידוד של תאי מיאלואידית דנדריטים ותאי האפיתל מקורנית האדם

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

הערכת התפתחותם של תאי Murine Plasmacytoid דנדריטים בתיקונים של Peyer באמצעות העברת מאמצת של אבות Hematopoietic

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

תאי T ללכוד חיידקים על ידי Transinfection מתאים דנדריטים

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

במבחנה הדור של תאי דנדריטים Murine Plasmacytoid מנפוצים הלימפה אבות באמצעות מערכת מזין AC-6

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

אפיון בידוד תזרים Cytometric של Murine קטנים מעיים לימפוציטים

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

בידוד ההפעלה של Murine לימפוציטים

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

דור של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים מן הדם מלא

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

לימפוציטים בידוד מן העכבר קטן המעי המערכת החיסונית

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...