Name: isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine peyer's patches
Uploaded: 2013-03-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches at JoVE.com

Ringraziamo canzone Renjie (Wadsworth Nucleo Centro Citometria di flusso) per l&#39;assistenza in analisi di cellule e Helen Johnson (Wadsworth Centro Animal Istopatologia Core) per la preparazione delle sezioni di paraffina. Ringraziamo il Dott. Richard A. Cole (Wadsworth Core Light Centro di microscopia) per l&#39;assistenza con la microscopia confocale e raccolta di immagini. Vorremmo riconoscere Andy Bentley (Wadsworth Center Foto e Illustrazione) per l&#39;assistenza con le animazioni. MDJ è supportato dal Life Sciences Research Foundation, Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Fellowship. SA è supportato da un Centro di Salute-borsa Wadsworth Research Inc. intramurale post-dottorato. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni NIH HD061916 e GM082978.

Gli animali sono stati alloggiati sotto convenzionali, esenti da organismi patogeni specifici condizioni e sono stati trattati nel pieno rispetto Institutional Animal Care del Centro Wadsworth e uso Comitato (IACUC) le linee guida. 1. Sonda gastrica <ol><li> (Opzionale) topo ceppo Gavage di scelta con l&#39;antigene o microbi di interesse utilizzando un 22 G x1.5-in. blunt-end ago alimentazione (Popper scientifico, New Hyde Park, NY). I volumi di consegna non deve superare i 400 microlitri...

<ol>
	<li>Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+IgA's+complex+roles+in+immunity+and+mucosal+homeostasis+in+the+gut.">Secretory IgA's complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut.</a> Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).</li><li>Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaboration+of+epithelial+cells+with+organized+mucosal+lymphoid+tissue.">Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue.</a> Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).</li><li>Rescigno, M., Sabatino, A. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+intestinal+homeostasis+and+disease.">Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease.</a> J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).</li><li>Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GALT:+organization+and+dynamics+leading+to+IgA+synthesis.">GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis.</a> Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).</li><li>Iwasaki, A., Kelsall, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+distinct+Peyer's+patch+dendritic+cell+subsets+and+their+recruitment+by+chemokines+macrophage+inflammatory+protein+(MIP)-3alpha,+MIP-3beta,+and+secondary+lymphoid+organ+chemokine.">Localization of distinct Peyer's patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine.</a> Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).</li><li>Iwasaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+dendritic+cells.">Mucosal dendritic cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).</li><li>Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peyer's+Patch+Dendritic+Cells+Sample+Antigens+by+Extending+Dendrites+Through+M+Cell-Specific+Transcellular+Pores.">Peyer's Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores.</a> Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).</li><li>Lelouard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+bacteria+and+dead+cells+are+internalized+by+a+unique+subset+of+Peyer's+patch+dendritic+cells+that+express+lysozyme.">Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer's patch dendritic cells that express lysozyme.</a> Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).</li><li>Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+toxin+induces+migration+of+dendritic+cells+from+the+subepithelial+dome+region+to+T-+and+B-cell+areas+of+Peyer's+patches.">Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches.</a> Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).</li><li>Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+IgA+possesses+intrinsic+modulatory+properties+stimulating+mucosal+and+systemic+immune+responses.">Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses.</a> J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).</li><li>Kelsall, B. L., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+populations+of+dendritic+cells+are+present+in+the+subepithelial+dome+and+T+cell+regions+of+the+murine+Peyer's+patch.">Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer's patch.</a> J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).</li><li>Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+Mouse+Ligated+Peyer's+Patch+Intestinal+Loop+Assay+to+Evaluate+Bacterial+Uptake+by+M+cells.">Application of a Mouse Ligated Peyer's Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells.</a> J. Vis. Exp. (58), e3225 (2011).</li><li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Dendritic+Cells+and+Macrophages+from+the+Mouse+Intestine.">Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine.</a> J. Vis. Exp. (63), e4040 (2012).</li><li>Lopez-Guerrero, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotavirus+infection+activates+dendritic+cells+from+Peyer's+patches+in+adult+mice.">Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer's patches in adult mice.</a> J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).</li></ol>

In questo articolo, abbiamo fornito protocolli paralleli per la preparazione di PP preparazioni di cellule singole per l&#39;analisi di citometria a flusso e funzionale e criosezioni per immunostaining. Entrambi i metodi sono altamente riproducibili e facilmente accessibile, fornito un citofluorimetro e criostato sono disponibili. Per investigatori prima volta è opportuno sottolineare che, rispetto alla milza, produzioni di cellule totali di PP sono relativamente scarse. Tuttavia, il protocollo delineiamo generalmente ...

Placche di Peyer (PP) sono aggregati macroscopici organizzati follicoli linfoidi presenti in tutto l&#39;intestino tenue di esseri umani e topi (Figura 1) e costituiscono i siti primari avviate mucosali risposte immunitarie contro antigeni alimentari, batteri commensali, patogeni microbici e vaccini orali 1-4. A differenza di altri tessuti linfoidi periferici, come i linfonodi mesenterici, PPs mancano vasi linfatici afferenti. Come tali, le risposte immunitarie in PP sono guidati in risposta ad antigeni derivati ​​dal lume intestinale. Il campionamento di antigeni luminali è compiuta la dal follicolo-associata epitelio (FAE), che consiste di due enterociti e antigene-campionamento cellule note come cellule M. Sotto la FAE, nel sub-epiteliale cupola (SED) regione, si trova una rete di cellule dendritiche (DC), mescolate con i macrofagi, cellule B e le cellule T CD4 + 5-9. Al centro di ogni follicl PP linfoidee sono cellule follicolari dendritiche (FDC) e una a cellule B ricco di centro in centro germinale, fiancheggiata da cellule T-zone ricche interfollicolari. Campionamento Antigen dai risultati PPs nello sviluppo di IgA + plasmablasts cellule B e le cellule effettrici CD4 + e la memoria che le sementi della lamina propria circostante e garantire l&#39;immunità a una vasta gamma di invasori della mucosa. Dissezione gli eventi immunologici complessi associati con il campionamento antigene, l&#39;elaborazione e la presentazione in PP è un compito arduo, considerando che le cellule PP costituiscono solo una piccola frazione delle cellule linfoidi in totale mucosa intestinale. Per aiutare nella caratterizzazione in vitro di cellule in questo ambiente, forniamo un protocollo per la preparazione di cellule totali topo PP per analisi citofluorimetrica e funzionale, nonché un protocollo per la preparazione di PP criosezioni per immunofluorescenza e immunoistologia. Il nostro protocollo per l&#39;isolamento, la caratterizzazione, e immunostaining di protocolli d&#39;intesaposta cellule PP non è nuova di per sé, come dimostra il fatto che ci sono numerosi riferimenti risalgono a più di 25 anni che citano queste tecniche 5,6,9-11. Piuttosto, il nostro protocollo prevede una snella (e visivo) Metodo per investigatori raccolta PPs per la prima volta. Le tecniche che descrivono facilmente padronanza e prontamente produrre un gran numero di cellule con&gt; la vitalità cellulare del 90%. Il protocollo criosezionamento produce sezioni seriali altamente riproducibili ideali per la colorazione e immunofluorescenza confocale. Inoltre, il nostro protocollo integra altri due articoli recenti Giove. Il primo, di Fukuda e colleghi, descrive l&#39;uso di saggi ligato anello ileali per valutare la diffusione dei batteri patogeni da PP cellule M 12. L&#39;altro, da Geem e colleghi, descrive l&#39;isolamento e la caratterizzazione di cellule dendritiche e macrofagi dalla mucosa intestinale del mouse, ma esclude esplicitamente dalla loro analisi PP 13.

<table border="1"><tbody><tr><td> Voce </td><td> Azienda </td><td> Cat. # </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Ottobre Compound </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 7x7x5 Stampi base mm </td><td> FISHERBRAND </td><td> 22-363-552 </td><td></td></tr><tr><td> ImmEdge Pen </td><td> Vector Labs </td><td> H-4000 </td><td></td></tr><tr><td> SuperFrost Plus Slides </td><td> Thermo Scientific </td><td> 4951 </td><td></td></tr><tr><td> Bordo Rite Lama </td><td> Thermo Scientific </td><td> 4280L </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mouse CD11c-PE </td><td> eBioscience </td><td> 17-0114-82</td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mouse CD45R/B220-APC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553092 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mouse CD3-FITC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 561798 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mouse CD4-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553652 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mouse CD8-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553032 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-topo CD19-PerCP </td><td> BioLegend </td><td> 115531 </td><td></td></tr><tr><td> Sale di Hank soluzione equilibrata (HBSS) senza rosso fenolo </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14175-079 </td><td></td></tr><tr><td> 70 micron filtro cella </td><td> BD Falcon </td><td&gt; 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Medio Spleen dissociazione </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 7915 </td><td></td></tr><tr><td> Siero di capra </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-072 </td><td></td></tr><tr><td> Fc Block </td><td> ATCC 2.4.G2 </td><td> HB-197 </td><td> Supes ottenuto da 2.4.G2 linea cellulare </td></tr><tr><td> Scissor curvo </td><td> FST </td><td> 14061-09 </td><td></td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Leica </td><td> 3050S </td><td></td></tr><tr><td> FACS Calibur </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Contessa Cella contatore </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ematossilina </td&gt; <td> Richard Allan </td><td> 7211 </td><td></td></tr><tr><td> Eosina </td><td> Richard Allan </td><td> 71304 </td><td></td></tr><tr><td> Formalina </td><td> Starplex scientifico </td><td> 3661 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 1. Reagenti e apparecchiature utilizzati in questo studio. </td></tr></tbody></table>

isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine peyer's patches

Placche di Peyer (PP) sono parte integrante dei tessuti linfoide associato all&#39;intestino (GALT) e gioca un ruolo centrale nella immunosorveglianza intestinale e l&#39;omeostasi. Antigeni particolato e microbi nel lume intestinale sono continuamente campionata da PP cellule M nel follicolo-associato epitelio (FAE) e trasportato a una rete sottostante di cellule dendritiche (DC), macrofagi e linfociti. In questo articolo, descriviamo protocolli in cui PPs murini sono (i) dissociato in sospensioni di cellule singole e sottoposti a citometria di flusso e (ii) preparato per criosezionamento e immunocolorazione. Per citometria di flusso, PP sono dissociate meccanicamente e poi filtrata attraverso membrane 70 micron per generare sospensioni di cellule singole libere delle cellule epiteliali e detriti grande. Partendo con 20-25 PP (da quattro topi), questo metodo veloce e riproducibile produce una popolazione di&gt; 2,5 x 10 6 cellule con&gt; vitalità cellulare del 90%. Per criosezionamento, frescoPP ly isolati sono immersi in ottimale temperatura di taglio (OCT) medio, snap-congelato in azoto liquido, e quindi sezionato con un cryomicrotome. Le sezioni di tessuto (5-12 micron) sono essiccati all&#39;aria, fissato con acetone o metanolo, e quindi sottoposti a immunomarcatura.

Analisi citofluorimetrica di sospensioni monodisperse del totale delle cellule PP rivela una chiara distinzione tra preparazioni di cellule buone e poveri. In preparazioni di cellule buoni rapporti con oltre l&#39;80% la redditività, la maggior parte delle cellule dimostrano alta forward scatter (FSC), un indicatore di volume cellulare alta, e disperdere lato basso (SSC), un indicatore di granularità delle cellule basso (Figura 2A). In questo esperimento, abbiamo anche volutamente preparato un &quot;c...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches at JoVE.com

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Vi è un crescente interesse per la comprensione delle funzioni immunologiche specifiche sottopopolazioni di cellule nelle placche di Peyer (PP), i siti primari induttivi di gut-tessuti linfoidi associati. Qui delineare protocolli paralleli per la preparazione di PP preparazioni di cellule singole per l&#39;analisi di citometria a flusso e criosezioni PP per immunostaining.

Isolare e Immunostaining linfociti e le cellule dendritiche da placche di Peyer murino di

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Generazione e l&#39;etichettatura di Murine osseo cellule dendritiche derivate dal midollo con nanocristalli Qdot per gli Studi inseguimento

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Isolamento e caratterizzazione di cellule dendritiche ei macrofagi dall&#39;intestino mouse

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolamento di cellule dendritiche mieloidi e cellule epiteliali di timo umano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Valutare lo sviluppo delle cellule murine plasmocitoidi dendritiche in placche del Peyer Utilizzando trasferimento adottivo di ematopoietiche Progenitori

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Cellule T Capture batteri da Transinfection da cellule dendritiche

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In Vitro Generazione di Murine plasmacitoidi dendritiche Cellule dal comune linfoide Progenitori utilizzando l&#39;AC-6 Alimentatore Sistema

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Isolamento e caratterizzazione citometria a flusso di Murine Piccolo intestinale Linfociti

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

L&#39;isolamento e l&#39;attivazione di linfociti murini

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generazione di derivate da monociti cellule dendritiche umane da sangue intero

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isolando i linfociti del sistema immunitario intestinale piccolo per Mouse

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...