Name: isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine peyer's patches
Uploaded: 2013-03-17T14:00:00
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我々は、パラフィン切片を調製するための細胞分析とヘレン·ジョンソン（ワズワースセンター動物組織病理コア）を支援するためのRenjie·ソング（ウォッズワースセンターのフローサイトメトリーコア）に感謝。我々は、共焦点顕微鏡と画像収集の支援については博士リチャードA·コール（ウォッズワースセンター光顕微鏡コア）に感謝。我々は、アニメーションの支援についてはアンディベントレー（ウォッズワースセンターの写真とイラスト）承認したいと思います。 MDJは、ライフサイエンス研究財団、ハワードヒューズ医学研究所（HHMI）フェローシップでサポートされています。 SAはワズワースセンター·ヘルスリサーチ株式会社学内ポスドクでサポートされています。この作品は、NIHの助成HD061916とGM082978によって部分的にサポートされていました。

動物は、従来、特定の病原体を含まない条件下で飼育し、ワズワースセンターの機関動物実験委員会（動物実験委員会）のガイドラインに完全に準拠して処理した。 1。経口胃管栄養法<ol><li> 22 G 1.5倍インを使用して、目的の抗原や微生物との選択（任意）強制経口マウス系統。平滑末端給餌針（Popperの科学、ニューハイドパーク、ニューヨーク州）。配達ボリューム?...

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	<li>Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+IgA's+complex+roles+in+immunity+and+mucosal+homeostasis+in+the+gut.">Secretory IgA's complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut.</a> Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).</li><li>Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaboration+of+epithelial+cells+with+organized+mucosal+lymphoid+tissue.">Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue.</a> Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).</li><li>Rescigno, M., Sabatino, A. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+intestinal+homeostasis+and+disease.">Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease.</a> J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).</li><li>Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GALT:+organization+and+dynamics+leading+to+IgA+synthesis.">GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis.</a> Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).</li><li>Iwasaki, A., Kelsall, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+distinct+Peyer's+patch+dendritic+cell+subsets+and+their+recruitment+by+chemokines+macrophage+inflammatory+protein+(MIP)-3alpha,+MIP-3beta,+and+secondary+lymphoid+organ+chemokine.">Localization of distinct Peyer's patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine.</a> Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).</li><li>Iwasaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+dendritic+cells.">Mucosal dendritic cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).</li><li>Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peyer's+Patch+Dendritic+Cells+Sample+Antigens+by+Extending+Dendrites+Through+M+Cell-Specific+Transcellular+Pores.">Peyer's Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores.</a> Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).</li><li>Lelouard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+bacteria+and+dead+cells+are+internalized+by+a+unique+subset+of+Peyer's+patch+dendritic+cells+that+express+lysozyme.">Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer's patch dendritic cells that express lysozyme.</a> Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).</li><li>Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+toxin+induces+migration+of+dendritic+cells+from+the+subepithelial+dome+region+to+T-+and+B-cell+areas+of+Peyer's+patches.">Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches.</a> Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).</li><li>Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+IgA+possesses+intrinsic+modulatory+properties+stimulating+mucosal+and+systemic+immune+responses.">Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses.</a> J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).</li><li>Kelsall, B. L., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+populations+of+dendritic+cells+are+present+in+the+subepithelial+dome+and+T+cell+regions+of+the+murine+Peyer's+patch.">Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer's patch.</a> J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).</li><li>Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+Mouse+Ligated+Peyer's+Patch+Intestinal+Loop+Assay+to+Evaluate+Bacterial+Uptake+by+M+cells.">Application of a Mouse Ligated Peyer's Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells.</a> J. Vis. Exp. (58), e3225 (2011).</li><li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Dendritic+Cells+and+Macrophages+from+the+Mouse+Intestine.">Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine.</a> J. Vis. Exp. (63), e4040 (2012).</li><li>Lopez-Guerrero, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotavirus+infection+activates+dendritic+cells+from+Peyer's+patches+in+adult+mice.">Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer's patches in adult mice.</a> J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).</li></ol>

この記事では、我々は免疫染色、フローサイトメトリーおよび機能解析および凍結切片のための単一細胞調製物を調製するためのPPのパラレルプロトコルを提供してきました。どちらの方法でも、フローサイトメーターとクライオスタットが利用可能である限り、再現性の高い、容易にアクセス可能です。初めての調査官のためには、脾臓と比較すると、PPSからの全細胞収量が比較的貧弱で?...

パイエル板（PPS）は、ヒトおよびマウスの小腸（ 図1）を全体に存在する組織化されたリンパ濾胞の巨視的凝集体であると粘膜免疫応答は食物抗原、共生細菌、病原微生物、及び経口ワクチンに対して開始されるときの主要な部位を構成1-4。このような腸間膜リンパ節など他の末梢リンパ組織とは異なり、PPは、輸入リンパ管を欠いている。このように、PPSに適応免疫応答は、腸管腔に由来する抗原に応答して駆動されています。管腔の抗原のサンプリングは、腸およびM細胞として知られている抗原のサンプリングセルの両方で構成されている濾胞関連上皮（FAE）によって達成される。 FAEの下に、サブ上皮ドーム（SED）の領域では、マクロファージ、B細胞、CD4 + T細胞は5月9日と混ざり樹状細胞（DC）のネットワークがあります。各PPリンパfolliclの中核にeは、濾胞樹状細胞（FDCS）とT細胞が豊富な濾胞ゾーンが隣接のB細胞が豊富な中央の胚中心である。のIgA + B細胞plasmablastsとCD4 +エフェクターとメモリセルの開発にPPSの結果による抗原サンプリングその種子周囲の粘膜固有層および粘膜侵略に広い範囲への耐性を提供します。 PPSの抗原サンプリング、処理、プレゼンテーションに関連する複雑な免疫学的事象を解剖すると、PP細胞が腸管粘膜における総リンパ球様細胞のごく一部を構成することを考えると、大変な作業です。この環境における細胞の in vitro での特性評価で支援するために、我々は、フローサイトメトリーおよび機能解析だけでなく、免疫蛍光顕微鏡および免疫組織学のための凍結切片を調製するためのPPのプロトコルのために全マウスのPP細胞を調製するためのプロトコルを提供する。覚書の分離、特性評価、および免疫染色のために、我々のプロトコル電子PPの細胞は、これらの技術を5,6,9-11を引用し 、25年以上さかのぼる多くの参照があるという事実によって証明されるように、 それ自体は小説ではありません。むしろ、我々のプロトコルは、初めてPPを集める研究者のための合理化された（とビジュアル）メソッドを提供します。私たちが説明する技術を容易に習得し、容易に&gt; 90％の細胞の生存率を持つ細胞を大量に産出されています。凍結セクショニングプロトコルは、理想的には、免疫蛍光染色し、共焦点イメージングに適した再現性の高い連続切片が得られます。さらに、我々のプロトコルは、2つの他の最近のJoveの記事を補完します。最初は、福田らは、12のPP M細胞による病原細菌の取り込みを評価するためにライゲート回腸ループアッセイの使用について説明します。もう一つは、Geemらによる、マウスの腸粘膜からの樹状細胞やマクロファージの単離および特性を説明していますが、明示的に分析13からPPを除外。

<table border="1"><tbody><tr><td> アイテム </td><td> 会社 </td><td> 猫。 ＃ </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> OCTコンパウンド</td><td>組織 - Tek社</td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 7x7x5 mmベース金型</td><td> Fisherbrand </td><td> 22-363-552 </td><td></td></tr><tr><td> ImmEdgeペン</td><td>ベクトルラボ</td><td> H-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrostプラススラ​​イド</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 4951 </td><td></td></tr><tr><td>エッジ儀式ブレイド</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 4280L </td><td></td></tr><tr><td>抗マウスのCD11c-PE </td><td> eBioscience社</td><td> 17-0114-82</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD45R/B220-APC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553092 </td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD3-FITC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 561798 </td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD4-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553652 </td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD8-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553032 </td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD19-PercP </td><td> BioLegend </td><td> 115531 </td><td></td></tr><tr><td>フェノールレッドを含まないハンクス平衡塩溶液（HBSS） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 14175-079 </td><td></td></tr><tr><td> 70μmのセルストレーナー</td><td> BDファルコン</td><tD&gt; 352350 </td><td></td></tr><tr><td>脾臓解離ミディアム</td><td>電池技術を食い止める</td><td> 7915 </td><td></td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>インビトロジェン</td><td> 16210-072 </td><td></td></tr><tr><td> FCブロック</td><td> ATCC 2.4.G2 </td><td> HB-197 </td><td>細胞株から得られた2.4.G2 Supes </td></tr><tr><td>湾曲したシザー</td><td> FST </td><td> 14061から09 </td><td></td></tr><tr><td>低温保持装置</td><td>ライカ</td><td> 3050S </td><td></td></tr><tr><td> FACSソウルキャリバー</td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td>伯爵セルカウンター</td><td>インビトロジェン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td&gt; <td>リチャード·アラン</td><td> 7211 </td><td></td></tr><tr><td>エオシン</td><td>リチャード·アラン</td><td> 71304 </td><td></td></tr><tr><td>ホルマリン</td><td> Starplex科学</td><td> 3661 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表1本研究で使用した試薬および装置。 </td></tr></tbody></table>

isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine peyer's patches

パイエル板（PPS）は腸管関連リンパ組織（GALT）の不可欠な構成要素であり、腸の免疫監視と恒常性に中心的な役割を果たします。腸管腔における粒子状抗原や微生物を連続濾胞関連上皮にPP M細胞によってサンプリング（FAE）と樹状細胞（DC）、マクロファージ、リンパ球の基盤となるネットワークに輸送される。この記事では、我々は、マウスのPPは、（i）単一細胞懸濁物に解離され、フローサイトメトリーにかけ、（ii）の凍結セクショニングと免疫染色のために準備されているプロトコルについて説明します。フローサイトメトリーのために、PPは機械的に解離され、次に上皮細胞と大きな破片の自由な単一の細胞懸濁液を生成するために70μmの膜を通して濾過した。 20から25 PPS（4匹から）以降では、この度は迅速かつ再現性のある方法は、&gt; 90％の細胞生存率&gt; 2.5×10 6細胞集団が得られます。凍結セクショニングのため、新鮮なLY孤立PPはcryomicrotomeを使用して、最適切断温度（OCT）培地、液体窒素で瞬間凍結し、切片に浸漬される。組織切片（5-12μm）は、アセトンやメタノールで固定し、空気乾燥され、その後免疫標識を行った。

合計PP細胞の単分散懸濁液を用いたフローサイトメトリー解析は良いと貧しい細胞調製の間に明確な区別を明らかにする。 80％以上の生存率との良好な細胞調製では、細胞の大半は高い前方散乱（FSC）、高細胞容積の指標、および低側方散乱（SSC）が、低い細胞粒度（ 図2A）のインジケータを示しています。この実験では、我々はまた、意図的に（代わりPHEMのPBSプラス1％FCSを含?...

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Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

パイエル板の細胞の特定の亜集団（PPS）、腸管関連リンパ組織の主要な誘導部位の免疫学的機能を理解する上で関心が高まっている。ここでは、フローサイトメトリー解析と免疫染色のためのPPの凍結切片のための単一細胞調製物を調製するためのPPのパラレルプロトコルの概要を説明します。

マウスのパイエル板のリンパ球や樹状細胞を単離し、免疫染色

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

追跡調査のためのQdot ®二ナノとマウス骨髄由来樹状細胞の世代とラベリング

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

マウスの腸からの樹状細胞およびマクロファージの単離とキャラクタリゼーション

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

ヒト胸腺からの骨髄樹状細胞と上皮細胞の単離

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

造血前駆細胞の養子移入を使用して、パイエル板におけるマウス形質細胞様樹状細胞の開発を評価

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

T細胞は、樹状細胞からTransinfectionによって細菌をキャプチャ

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

AC-6フィーダシステムを使用してリンパ球系共通前駆細胞からマウス形質細胞様樹状細胞のインビトロ生成に

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

マウスの小腸リンパ球の単離およびフローサイトメトリーキャラクタリゼーション

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

単離とマウスリンパ球の活性化

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

全血からのヒト単球由来樹状細胞の生成

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

マウス小腸管免疫系からリンパ球を分離すること

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...