Name: isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine peyer's patches
Uploaded: 2013-03-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches at JoVE.com

Мы благодарим Renjie Song (Wadsworth центр проточной цитометрии Core) за помощь в анализе клеток и Хелен Джонсон (Wadsworth Центра животных Гистопатология Core) для приготовления парафиновых срезов. Мы благодарим д-р Ричард Э. Коул (Wadsworth Центра световой микроскопии Core) за помощь в конфокальной микроскопии и коллекции изображений. Мы хотели бы поблагодарить Энди Bentley (Wadsworth центр Фото и иллюстрации) за помощь с анимацией. MDJ при поддержке Фонда исследований науки о жизни, Медицинского института Говарда Хьюза (HHMI) Fellowship. SA при поддержке Центра Wadsworth-Health Research Инк очной докторской стипендии. Эта работа была частично поддержана грантами NIH HD061916 и GM082978.

Животные были размещены в обычных, специфических патогенов без условий и лечились в полном соответствии с институциональной животных Wadsworth центра по уходу и использованию комитета (IACUC) руководящих принципов. 1. Желудочный зонд <ol><li> (Необязательно) зонд мыши штамма выб?...

<ol>
	<li>Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+IgA's+complex+roles+in+immunity+and+mucosal+homeostasis+in+the+gut.">Secretory IgA's complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut.</a> Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).</li><li>Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaboration+of+epithelial+cells+with+organized+mucosal+lymphoid+tissue.">Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue.</a> Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).</li><li>Rescigno, M., Sabatino, A. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+intestinal+homeostasis+and+disease.">Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease.</a> J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).</li><li>Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GALT:+organization+and+dynamics+leading+to+IgA+synthesis.">GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis.</a> Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).</li><li>Iwasaki, A., Kelsall, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+distinct+Peyer's+patch+dendritic+cell+subsets+and+their+recruitment+by+chemokines+macrophage+inflammatory+protein+(MIP)-3alpha,+MIP-3beta,+and+secondary+lymphoid+organ+chemokine.">Localization of distinct Peyer's patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine.</a> Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).</li><li>Iwasaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+dendritic+cells.">Mucosal dendritic cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).</li><li>Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peyer's+Patch+Dendritic+Cells+Sample+Antigens+by+Extending+Dendrites+Through+M+Cell-Specific+Transcellular+Pores.">Peyer's Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores.</a> Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).</li><li>Lelouard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+bacteria+and+dead+cells+are+internalized+by+a+unique+subset+of+Peyer's+patch+dendritic+cells+that+express+lysozyme.">Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer's patch dendritic cells that express lysozyme.</a> Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).</li><li>Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+toxin+induces+migration+of+dendritic+cells+from+the+subepithelial+dome+region+to+T-+and+B-cell+areas+of+Peyer's+patches.">Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches.</a> Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).</li><li>Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+IgA+possesses+intrinsic+modulatory+properties+stimulating+mucosal+and+systemic+immune+responses.">Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses.</a> J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).</li><li>Kelsall, B. L., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+populations+of+dendritic+cells+are+present+in+the+subepithelial+dome+and+T+cell+regions+of+the+murine+Peyer's+patch.">Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer's patch.</a> J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).</li><li>Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+Mouse+Ligated+Peyer's+Patch+Intestinal+Loop+Assay+to+Evaluate+Bacterial+Uptake+by+M+cells.">Application of a Mouse Ligated Peyer's Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells.</a> J. Vis. Exp. (58), e3225 (2011).</li><li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Dendritic+Cells+and+Macrophages+from+the+Mouse+Intestine.">Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine.</a> J. Vis. Exp. (63), e4040 (2012).</li><li>Lopez-Guerrero, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotavirus+infection+activates+dendritic+cells+from+Peyer's+patches+in+adult+mice.">Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer's patches in adult mice.</a> J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).</li></ol>

В этой статье мы предоставили параллельных протоколов для подготовки PP одного клеточные препараты для проточной цитометрии и функционального анализа и cryosections для иммунной окраски. Оба метода являются высокая воспроизводимость и легко доступны, при условии, цитометра и криостат имею?...

Пейеровы бляшки (ПП) являются макроскопические агрегаты организованных лимфоидных фолликулов присутствует во всем тонком кишечнике людей и мышей (рис. 1) и составляют основные сайты, на которых слизистых иммунных ответов, возбужденное в отношении диетических антигенов, синантропных бактерий, патогенных микроорганизмов, а также пероральных вакцин 1-4. В отличие от других периферических лимфоидных тканей, таких как мезентериальных лимфатических узлов, PPS не хватает афферентные лимфатические сосуды. Таким образом, адаптивный иммунный ответ в PPs приводятся в ответ на антигены, полученные из просвета кишечника. Выборка просвета антигенов осуществляется по фолликула связанных эпителия (FAE), который состоит как из энтероцитов и антиген-отбор проб клеток, известных как М-клетки. Под FAE, в суб-эпителиальные купола (SED) области, лежит сети дендритные клетки (ДК) смешались с макрофагами, В-клетки и CD4 + Т-клетки 5-9. В основе каждой PP лимфоидной folliclе, фолликулярные дендритные клетки (ФСКН) и В-клеток, богатых центрального зародышевого центра, в окружении Т-клеток богатых зон интерфолликулярной. Антиген отбора образцов, ПП результатов в развитии IgA + В-клеток plasmablasts и CD4 +-эффекторов и клеток памяти, что семена окружающих ргорпа пластинки и обеспечивает иммунитет к широкому спектру к слизистой оболочке захватчиков. Пройдя сложные события, связанные с иммунологической антиген выборки, обработки и представления в PPs является непростой задачей, учитывая, что PP клетки составляют лишь малую долю от общего лимфоидных клеток в слизистой оболочке кишечника. Чтобы помочь в в пробирке характеристика клеток в этой среде, мы предоставляем протокол для подготовки общего мыши PP ячеек для проточной цитометрии и функционального анализа, а также протокол для подготовки PP cryosections для иммунофлуоресцентного микроскопии и immunohistology. Наш протокол для выделения, характеристика и иммуноокрашивания МоВэлектронной PP клеток не нова сама по себе, о чем свидетельствует тот факт, что имеются многочисленные ссылки насчитывает более 25 лет, что привести эти методы 5,6,9-11. Скорее всего, наш протокол обеспечивает обтекаемый (и визуальный) метод для следователей сбора PPs в первый раз. Методы мы опишем легко освоили и легко получить большое количество клеток с&gt; 90% жизнеспособность клеток. Cryosectioning протокол дает высокую воспроизводимость серийных срезов идеально подходит для окрашивания иммунофлуоресценции и конфокальной микроскопии. Кроме того, наш протокол дополняет два других недавних статей Юпитера. Во-первых, Фукуда и коллег, описывает использование лигированную подвздошной анализы цикла для оценки поглощения патогенных бактерий PP клетки M 12. Другой, Geem и коллег, описывает выделение и характеристика ДК и макрофагов мыши слизистой оболочки кишечника, но явно исключает ПП от их анализ 13.

<table border="1"><tbody><tr><td> Пункт </td><td> Компания </td><td> Кат. # </td><td> Комментарии (по желанию) </td></tr><tr><td> Соединение октября </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 7x7x5 мм Формы базы </td><td> Fisherbrand </td><td> 22-363-552 </td><td></td></tr><tr><td> ImmEdge Pen </td><td> Vector Labs </td><td> H-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost Plus Слайды </td><td> Thermo Scientific </td><td> 4951 </td><td></td></tr><tr><td> Пограничный Rite лезвия </td><td> Thermo Scientific </td><td> 4280L </td><td></td></tr><tr><td> Anti-мышь CD11c-PE </td><td> eBioscience </td><td> 17-0114-82</td><td></td></tr><tr><td> Anti-мышь CD45R/B220-APC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553092 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-мышь CD3-FITC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 561798 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-мышь CD4-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553652 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-мышь CD8-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553032 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-мышь CD19-PerCP </td><td> BioLegend </td><td> 115531 </td><td></td></tr><tr><td> Сбалансированный солевой раствор Хенкса (HBSS) без фенола красного </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14175-079 </td><td></td></tr><tr><td> 70 мкм ячейки фильтра </td><td> BD Falcon </td><tD&gt; 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Средний селезенки Диссоциация </td><td> Стволовые клетки технологий </td><td> 7915 </td><td></td></tr><tr><td> Коза сыворотке </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-072 </td><td></td></tr><tr><td> Fc блока </td><td> ATCC 2.4.G2 </td><td> HB-197 </td><td> Supes получить из ячейки 2.4.G2 линии </td></tr><tr><td> Изогнутые ножницы </td><td> FST </td><td> 14061-09 </td><td></td></tr><tr><td> Криостат </td><td> Leica </td><td> 3050S </td><td></td></tr><tr><td> FACS Calibur </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Графиня Счетчик клеток </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Гематоксилин </td&gt; <td> Richard Allan </td><td> 7211 </td><td></td></tr><tr><td> Эозин </td><td> Richard Allan </td><td> 71304 </td><td></td></tr><tr><td> Формалин </td><td> Starplex Научные </td><td> 3661 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Таблица 1. Реагенты и оборудование, используемые в этом исследовании. </td></tr></tbody></table>

isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine peyer's patches

Пейеровы бляшки (ПП) являются неотъемлемой частью кишечника, лимфоидной ткани (GALT) и играют центральную роль в кишечном иммунологического и гомеостаза. Частицы антигенов и микроорганизмов в просвете кишечника постоянно, отобранных PP клетки M в фолликул связанных эпителия (FAE) и транспортируется в основной сети дендритные клетки (ДК), макрофаги и лимфоциты. В этой статье мы опишем протоколы, в которых мышиные ПП являются: (I) распадается на одном суспензии клеток и подвергали проточной цитометрии и (II), подготовленный для cryosectioning и иммунной. Для проточной цитометрии, PPS механически диссоциированных и затем фильтруют через 70 мкм мембран для создания одного клеточные суспензии бесплатно эпителиальных клеток и крупного мусора. Начиная с 20-25 PPS (от четырех мышей), этот быстрый и воспроизводимый метод дает населению&gt; 2,5 х 10 6 клеток с&gt; 90% жизнеспособность клеток. Для cryosectioning, свежиеют изолированным PPs погружены в оптимальной температуры резания (ОКТ) среды, оснастки замороженной в жидком азоте, а затем разрезе использования cryomicrotome. Срезы тканей (5-12 мкм), сушат на воздухе, фиксировали ацетоном или метанолом, а затем подвергают иммунного.

Проточной цитометрии анализа монодисперсных суспензий от общего числа клеток PP показывает четкое различие между хорошей и плохой подготовкой клетки. В хорошем клеточные препараты с более чем 80% жизнеспособность, подавляющее большинство клеток демонстрируют высокую рассеяния вперед...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches at JoVE.com

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Существует растущий интерес в понимании иммунологических функций конкретной субпопуляции клеток в Пейеровы бляшки (PPS), первичные индуктивных участков кишечника связанных лимфоидной ткани. Здесь мы наметим параллельных протоколов для подготовки PP одного клеточные препараты для проточной цитометрии анализа и PP cryosections для иммунной окраски.

Изоляция и Иммуноокрашивание лимфоциты и дендритные клетки из мышиных Патчи Пейера

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Генерация и маркировки костного мозга мышей-дендритных клеток с Qdot нанокристаллов для отслеживания исследований

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Выделение и характеристика дендритных клеток и макрофагов из кишечника мыши

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Изоляция миелоидных дендритных клеток и эпителиальных клеток из человеческого тимуса

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Оценивая развитие мышей плазмацитоидных дендритных клеток в пейеровых бляшках Использование приемных передачи гемопоэтических прародителей

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Т-клеток Захват бактерий Transinfection от дендритных клеток

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Экстракорпоральное поколение мышиный плазмоцитов дендритных клеток из общего предшественники лимфоидных клеток с использованием Feeder System АС-6

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Выделение и проточной цитометрии Характеристика мышиных лимфоцитах тонкого кишечника

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

Выделение и активация мышиных лимфоцитах

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Поколение человеческих моноцитов дендритных клеток из цельной крови

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Изоляция лимфоциты от мыши небольшой кишечной иммунной системы

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...