Name: isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine peyer's patches
Uploaded: 2013-03-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches at JoVE.com

Biz hücre analizi ve kesitler hazırlamak için Helen Johnson (Wadsworth Merkezi Hayvan Histopatoloji Çekirdek) yardım için Renjie Song (Wadsworth Merkezi Akış Sitometri Çekirdek) teşekkür ederim. Biz konfokal mikroskopi ve görüntü toplama konusunda yardım almak için Dr Richard A. Cole (Wadsworth Merkezi Işık Mikroskobu Çekirdek) teşekkür ederim. Biz animasyonlar ile yardım için Andy Bentley (Wadsworth Center Fotoğraf ve İllüstrasyon) kabul etmek istiyorum. MDJ Yaşam Bilimleri Araştırma Vakfı, Howard Hughes Tıp Enstitüsü (HHMI) Kardeşliği tarafından desteklenmektedir. SA Wadsworth Merkezi-Sağlık Araştırma A.Ş. intramural doktora sonrası dostluk tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma NIH hibe HD061916 ve GM082978 tarafından kısmen desteklenmiştir.

Hayvanlar geleneksel, spesifik patojen free koşullarda muhafaza edildi ve Wadsworth Merkezi&#39;nin Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (IACUC) kurallarına tam uyumlu olarak tedavi edildi. 1. Oral Gavaj <ol><li> 22 G x1.5-kullanarak ilgi antijen veya mikroplarla seçim (İsteğe bağlı) Gavaj fare zorlanma. Künt uç besleme iğne (Popper Bilimsel, New Hyde Park, NY). Teslimat hacimleri fare başına 400 ul geçmemelidir. </li></ol> 2. Akış sitometrisi iç...

<ol>
	<li>Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+IgA's+complex+roles+in+immunity+and+mucosal+homeostasis+in+the+gut.">Secretory IgA's complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut.</a> Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).</li><li>Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaboration+of+epithelial+cells+with+organized+mucosal+lymphoid+tissue.">Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue.</a> Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).</li><li>Rescigno, M., Sabatino, A. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+intestinal+homeostasis+and+disease.">Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease.</a> J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).</li><li>Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GALT:+organization+and+dynamics+leading+to+IgA+synthesis.">GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis.</a> Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).</li><li>Iwasaki, A., Kelsall, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+distinct+Peyer's+patch+dendritic+cell+subsets+and+their+recruitment+by+chemokines+macrophage+inflammatory+protein+(MIP)-3alpha,+MIP-3beta,+and+secondary+lymphoid+organ+chemokine.">Localization of distinct Peyer's patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine.</a> Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).</li><li>Iwasaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+dendritic+cells.">Mucosal dendritic cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).</li><li>Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peyer's+Patch+Dendritic+Cells+Sample+Antigens+by+Extending+Dendrites+Through+M+Cell-Specific+Transcellular+Pores.">Peyer's Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores.</a> Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).</li><li>Lelouard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+bacteria+and+dead+cells+are+internalized+by+a+unique+subset+of+Peyer's+patch+dendritic+cells+that+express+lysozyme.">Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer's patch dendritic cells that express lysozyme.</a> Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).</li><li>Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+toxin+induces+migration+of+dendritic+cells+from+the+subepithelial+dome+region+to+T-+and+B-cell+areas+of+Peyer's+patches.">Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches.</a> Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).</li><li>Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+IgA+possesses+intrinsic+modulatory+properties+stimulating+mucosal+and+systemic+immune+responses.">Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses.</a> J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).</li><li>Kelsall, B. L., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+populations+of+dendritic+cells+are+present+in+the+subepithelial+dome+and+T+cell+regions+of+the+murine+Peyer's+patch.">Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer's patch.</a> J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).</li><li>Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+Mouse+Ligated+Peyer's+Patch+Intestinal+Loop+Assay+to+Evaluate+Bacterial+Uptake+by+M+cells.">Application of a Mouse Ligated Peyer's Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells.</a> J. Vis. Exp. (58), e3225 (2011).</li><li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Dendritic+Cells+and+Macrophages+from+the+Mouse+Intestine.">Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine.</a> J. Vis. Exp. (63), e4040 (2012).</li><li>Lopez-Guerrero, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotavirus+infection+activates+dendritic+cells+from+Peyer's+patches+in+adult+mice.">Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer's patches in adult mice.</a> J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).</li></ol>

Bu yazıda, immün akım sitometri ve fonksiyonel analiz ve cryosections için tek hücre hazırlıkları PP hazırlamak için paralel protokolleri sağlamıştır. Her iki yöntem bir akış sitometresinin ve kriyostat olarak sağlanır, yüksek oranda tekrarlanabilir ve kolayca erişilebilir. Ilk kez araştırmacılar için bu dalak göre, santrallerin toplam hücre verimleri nispeten yetersiz olduğuna işaret edilmelidir. Bununla birlikte, protokol biz genellikle tek bir fare 0,8-1,2 x 10 6 toplam PP hüc...

Peyer plaklarında (PPs) insan ve farelerde (Şekil 1) ince barsak boyunca mevcut organize lenfoid folikül makroskopik büyüklükler ve mukozal immün yanıtları diyet antijenler, komensal bakteriler, mikrobiyal patojenler ve oral aşılar karşı başlatılan hangi birincil siteler teşkil 1-4. Böyle mezenterik lenf düğümleri gibi diğer periferal lenfoid dokuların aksine, PPs afferent lenfatikler yoksundur. PPs böyle, adaptif immün yanıtları intestinal lümen elde antijenlere yanıt olarak tahrik gibi. Luminal antijenlerinin örnekleme M hücreleri olarak bilinen enterocytes ve antijen-örnekleme hücrelerinin her iki oluşan folikül ilişkili epitel (FAE) ile gerçekleştirilmektedir. FAE altında, alt-epitelyal kubbe (SED) bölgesinde, makrofaj, B hücreleri ve CD4 + T hücreleri 5-9 ile iç içe dendritik hücreler (DC) bir ağ yatıyor. Her PP lenfoid follicl özündeE foliküler dendritik hücreler (FDCs) ve T hücreden zengin interfolliküler zonları ile çevrili bir B hücre zengini Orta germinal merkez vardır. IgA + B hücre plasmablasts ve CD4 + efektör ve bellek hücrelerinin gelişiminde PPs sonuçları Antijen örnekleme o tohumu çevreleyen lamina propria ve mukoza işgalciler geniş bir bağışıklık sağlar. PPs antijen örnekleme, işleme ve sunum ile ilişkili kompleks immünolojik olaylar Diseksiyon PP hücreleri bağırsak mukozasında toplam lenfoid hücrelerin ancak çok küçük bir kısmını teşkil ettiği göz önüne alındığında, zor bir iştir. Bu ortamda hücrelerin in vitro olarak karakterize yardımcı olmak için, akış sitometrisi ve işlevsel analizi, hem de immün flüoresan mikroskopi ve immünohistoloji için cryosections PP hazırlanması için bir protokol için toplam fare PP hücrelerinin hazırlanması için bir protokol sağlar. Mous izolasyonu, karakterizasyonu ve immun Bizim protokolE PP hücreleri bu teknikler 5,6,9-11 cite daha 25 yıl öncesine tarihlenen çok sayıda başvuru olduğu gerçeğini kanıtladığı, başlı başına roman değildir. Aksine, protokol, ilk kez için PPs toplama araştırmacılar için düzenlenmiş bir (görme ve) bir yöntem sağlar. Bizim tarif teknikler kolayca hakim ve kolayca&gt;% 90 hücre canlılığı ile hücrelerin büyük sayıda elde edilir. Cryosectioning protokolü ideal immünofloresan boyama ve konfokal görüntüleme için uygun son derece tekrarlanabilir seri kesitler verir. Ayrıca, protokol diğer iki yeni vallahi makaleler tamamlar. İlk, Fukuda ve arkadaşları tarafından, PP M hücreleri 12 ile patojen bakterilerin alımını değerlendirmek için bağlanan ileal loop testlerinin kullanımı anlatılmaktadır. Diğer, Geem ve arkadaşları tarafından, DC&#39;ler ve fare intestinal mukozadan makrofaj izolasyonu ve karakterizasyonu açıklar, ancak açıkça onların analiz 13 PPs dışlar.

<table border="1"><tbody><tr><td> Madde </td><td> Şirket </td><td> Kedi. # </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Ekim Bileşik </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 7x7x5 mm Taban Kalıpları </td><td> Fisherbrand </td><td> 22-363-552 </td><td></td></tr><tr><td> ImmEdge Kalem </td><td> Vektör Labs </td><td> H-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost Artı Slaytlar </td><td> Thermo Scientific </td><td> 4951 </td><td></td></tr><tr><td> Kenar Rite Blade </td><td> Thermo Scientific </td><td> 4280L </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Fare CD11c-PE </td><td> eBioscience </td><td> 17-0114-82</td><td></td></tr><tr><td> Anti-fare CD45R/B220-APC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553092 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-fare CD3-FITC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 561798 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-fare CD4-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553652 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-fare CD8-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553032 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Fare CD19-PercP </td><td> BioLegend </td><td> 115531 </td><td></td></tr><tr><td> Fenol kırmızısı olmaksızın Hank&#39;in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14175-079 </td><td></td></tr><tr><td> 70 mikron hücre süzgecinden </td><td> BD Falcon </td><td&gt; 352.350 </td><td></td></tr><tr><td> Dalak Ayrışma Orta </td><td> Hücre Teknolojileri Stem </td><td> 7915 </td><td></td></tr><tr><td> Keçi serumu </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-072 </td><td></td></tr><tr><td> Fc Blok </td><td> ATCC 2.4.G2 </td><td> HB-197 </td><td> Supes hücre hattı elde 2.4.G2 </td></tr><tr><td> Kavisli Makas </td><td> FST </td><td> 14061-09 </td><td></td></tr><tr><td> Kriyostat </td><td> Leica </td><td> 3050S </td><td></td></tr><tr><td> FACS Calibur </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kontes Hücre Sayacı </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hematoksilen </td&gt; <td> Richard Allan </td><td> 7211 </td><td></td></tr><tr><td> Eosin </td><td> Richard Allan </td><td> 71304 </td><td></td></tr><tr><td> Formalin </td><td> Starplex Bilimsel </td><td> 3661 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tablo 1. Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipman. </td></tr></tbody></table>

isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine peyer's patches

Peyer plaklarında (PPs) gut-ilişkili lenfoid dokuların ayrılmaz bileşenleri (GALT) ve intestinal immünosürveylansında ve homeostasis merkezi bir rol oynamaktadır. Bağırsak lümeninde Partikül antijen ve mikrop sürekli folikül ilişkili epitel (FAE) PP M hücreleri tarafından örneklenmiş ve altta yatan bir dendritik hücreler ağı (DC&#39;ler), makrofajlar ve lenfositler taşınmaktadır. Bu yazıda, murin PPs (i) tek hücre süspansiyonları içine uzaklaşılmış ve akım sitometri tabi ve (ii) cryosectioning ve immün için hazırlanan hangi protokolleri tanımlar. Flow sitometri için santrallerin mekanik ayrılmış ve daha sonra epitel hücreleri ve büyük enkaz ücretsiz tek hücre süspansiyonları üretmek için 70 mikron membran ile filtre vardır. 20-25 PPs (dört fareler) ile başlayarak, bu hızlı ve tekrarlanabilir bir yöntemdir&gt; 2,5 nüfusu verir x 10&gt; 90% hücre canlılığı ile 6 hücre. Cryosectioning, taze içinly izole PPs bir cryomicrotome kullanarak o Optimal Kesme Sıcaklık (OCT) orta, sıvı azot içinde ek dondurulmuş ve kesitli batırılır. Doku kesitleri (5-12 mikron), aseton veya metanol ile tespit edilmiş, hava ile kurutulmuş, ve daha sonra immün tabi tutulmuştur.

Toplam PP hücreleri monodisperse süspansiyonlarının akış sitometrik analizi, iyi ve kötü hücre hazırlıkları arasında net bir ayrım ortaya koymaktadır. % 80&#39;in üzerinde canlılığı ile iyi cep hazırlıkları, hücreler büyük çoğunluğu yüksek ileri saçılım (FSC), yüksek hücre hacmi bir göstergesi ve düşük yan dağılım (SSC), düşük hücre granülarite (Şekil 2A) bir göstergesi gösterir. Bu deneyde, biz de kasıtlı (yerine PHEM PBS artı% 1 FCS ile hücreler ku...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches at JoVE.com

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer plaklarında hücrelerin belirli altgrupları (PPs), gut-ilişkili lenfoid dokuların primer endüktif sitelerin immünolojik işlevlerini anlamak giderek artan bir ilgi var. Burada akım sitometri analizi ve immun için PP cryosections için tek hücre hazırlıkları PP hazırlamak için paralel protokolleri anahat.

Lenfositler ve mürin Peyer en Yamalar itibaren Dendritik Hücreler İzolasyon Ve immün

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

İzleme Araştırmaları Qdot nanokristaller murin Kemik İliği-türevli dendritik hücrelerin üretilmesi ve Etiketleme

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Fare Barsak ayrı dendritik hücreler ve makrofajlar İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

İnsan Thymus ile myeloid dendritik hücreleri ve epitel hücreleri İzolasyonu

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Hematopoetik progenitörlerin Evlatlık Transferi kullanarak Peter Parçacıklannda Murin plazmasitoid dendritik hücreleri Gelişimini değerlendirilmesi

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

T hücreleri dendritik hücreler gelen Transinfection tarafından Bakteriler Yakalama

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

AC-6 Besleyici Sistemi kullanılarak Ortak Lenfoid progenitörlerin dan Fare plazmositoid dendritik hücreler İn Vitro Nesil

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Fare Küçük Bağırsak Lenfositler izolasyonu ve Akım Sitometrisi Karakterizasyonu

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

İzolasyon ve murin lenfositlerin aktivasyonu

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Tüm kan İnsan monosit türevli dendritik hücrelerin oluşumu

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...