Name: real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein
Uploaded: 2013-01-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein at JoVE.com

بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح R01EY018144.

1. الإنتاج، وطوي ثانية، وتنقية HPLC من هولو-RBP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل BL-21cells مع ناقلات pET3a لإيواء [كدنا] RBP الإنسان مع البطاقات صاحب 6X على محطة-N. تحول زراعة BL-21 في الخلايا شاكر في C ° 37 في 40 مل مع وسائل الإعلام LB كربنيسيلين حتى OD في 600 نانومتر تص...

نحن هنا لتبادل الإنتاج RBP الأمثل لبروتوكول RBP إنتاج وتنقية الإجراءات الحاسمة لتوليد RBP مطوية بشكل صحيح. نظرا لإمكانية الأنواع RBP تتجمع وجود كميات ضئيلة من البروتينات البكتيرية حتى في HPLC تنقية البكتيريا المنتجة RBP، فمن المفيد استخدام الممارسات التجارية التقييدية الأص...

فيتامين A هو جزيء العضوية التي لا غنى عنها لبقاء الإنسان وحسن سير جميع أجهزة الإنسان تقريبا. فيتامين A المشتقات (الرتينوئيدات) المشاركة في مختلف الأحداث البيوكيميائية والخلوية بما في ذلك الاستشعار من الضوء لرؤية 1،2 وتنظيم التعبير الجيني والترجمة البروتين أثناء التطور الجنيني والكبار في الأنسجة 3-6. على الرغم من الريتينول لديه القدرة على نشر نظام ككل، وجاء مع تطور البلازما بروتين ملزمة الريتينول، وهو بروتين الناقل محددة لفيتامين (أ) النقل في الدم لتحقيق الكفاءة العالية والدقة وتجنب السمية المرتبطة نشر عشوائي 7-10. A مستقبلات عالية تقارب الممارسات التجارية التقييدية التي تربط لويستغرق فيتامين A كان الافتراض في 1970s و11-13. على الرغم من الأدلة المتراكمة منذ ثلاثة عقود على وجود مستقبلات RBP 14-31، وناقشت فرضية مستقبلات لسنوات عديدة نظرا لexistenc(ه) من تعريف غير صحيح من هولو-RBP. التعريف الصحيح للهولو-RBP هو أنه هو مجمع عالية تقارب بين الريتينول 01:01 والممارسات التجارية التقييدية. استخراج المتكررة من قبل هولو-RBP المذيبات العضوية ضروري لإنتاج APO-RBP. ويستخدم هذا التعريف من قبل مختبرات كلها تقريبا دراسة RBP 7،9،32-35 أو مستقبلات RBP 14-31،36-42. تعريف غير صحيح من هولو-RBP الذي تم استخدامه لدحض وجود مستقبلات RBP هو خليط من الريتينول الحاد الحرة مع APO-RBP. منذ وظيفة مستقبلات فيتامين A في RBP امتصاص من هولو-RBP هو الافراج عن الريتينول من هولو-RBP، فإن مستقبلات RBP تلعب أي دور في امتصاص فيتامين الريتينول إذا مجاني لتبدأ (على النحو الذي اقترحه تعريف غير صحيح من هولو -RBP). دعا مؤخرا تحديد مستقبلات RBP باعتبارها multitransmembrane البروتين مجال STRA636 وظيفتها في امتصاص فيتامين A-من هولو RBP 36-43 يجادل بقوة ضد فرضية أن لا RBPتحتاج إلى مستقبلات فيتامين لتقديم تحليلات مفصلة A. كشفت أن لديها STRA6 المجالات عبر الغشاء 9 مع محطة تقع خارج الخلية-N وC-تقع محطة داخل خلوي 40. عبر الغشاء الواقع بين 6 و 7 هو مجال الممارسات التجارية التقييدية الأساسية ملزمة 39. ويقترن STRA6 على حد سواء والانتقال بعيد المدى المحددة CRBP-I في امتصاص فيتامين A-RBP من هولو، ولكن لا الانتقال بعيد المدى المحددة ولا CRBP-I. مطلوب للغاية لتعزيز النشاط STRA6 41 القدرة على تحفيز STRA6 الريتينول بيان من هولو-RBP هو المفتاح لفيتامين A في نشاط امتصاص 41. من خلال الاعتماد على STRA6 لاطلاق سراح الريتينول، ويمكن التسليم عن طريق فيتامين (أ) فيتامين (أ) نقل RBP لاستهداف الخلايا في الأنسجة الطرفية مع خصوصية عالية وكفاءة. ويتضح على الأهمية الحاسمة لتعريف هولو-RBP وليس فقط عن طريق إعداد النقاش التاريخية على وجود مستقبلات RBP، ولكن أيضا من خلال الورقات الثلاث الأخيرة ذات الصلة على أساس تعريفات DIF-هولو RBPferent من التعريف الأصلي والصحيح 44-46. استخدام الورقة الأولى التعريف هولو-RBP التي تم استخدامها في رفض وجود مستقبلات RBP لدراسة مستقبلات RBP 44. جاء الأوراق الثاني والثالث إلى تعريف الثالث من هولو-RBP التي جعلت من أقل احتمالا لالريتينول إلى دراسة لتشكيل مجمع السليم مع RBP 45،46. أعدت هذه الدراسات عن طريق خلط 3 H-retinol/RBP هولو-RBP (ولا حتى APO-RBP) مع 3 H-الريتينول. وبما أن هذا الفحص لم ديك 3 H-retinol/RBP شكلت ولم إزالة المفرط مجانا 3 H-الريتينول 45،46، فإنه ليس مقايسة لامتصاص فيتامين H-3 من 3 H-retinol/RBP، ولكن هو حر 3 نشر الفحص H-الريتينول. فقد تبين في وقت سابق ان STRA6 لا يعزز امتصاص الخلوية من الريتينول مجانا من الانتقال بعيد المدى المحددة 38 أو CRBP-I 41. تقريبا لا بد لجميع الممارسات التجارية التقييدية الريتينول في الدم وعدم وجود كشف الصحائفه الريتينول. A المهمة الرئيسية للمستقبلات RBP هو تحفيز إطلاق الريتينول من هولو-RBP خلال امتصاص فيتامين إي من هولو-RBP 41. إذا تم الافراج بشكل مصطنع أو الريتينول في شكل حر لتبدأ 45،46، ليست هناك حاجة لمستقبلات RBP. النتائج مختلفة بشكل كبير تم الحصول عليها من فحص مجاني نشر الريتينول بالمقارنة مع المقايسات يعتمد على استعداد بشكل صحيح هولو-RBP توضيح أن إعداد الصحيح للRBP أمر حاسم لفحوصات جانه الفنية. يمكن تنقيته من مصل الإنسان RBP 41، لكن الإجراء معقد والعائد منخفض. نهج بديل هو إنتاج RBP في E. القولونية. لأن E. القولونية ليس لديها القدرة على أضعاف بشكل صحيح الثدييات البروتينات يفرز مع أكثر من زوج واحد من السندات ثاني كبريتيد مثل RBP، لا بد من الممارسات التجارية التقييدية refold وتنقية البروتين مطوية بشكل صحيح. البروتينات تتجمع لا تتصرف بشكل مختلف عن RBP فقط مطوية تصحيحه في المقايسات المختلفة،ولكن يمكن أيضا أن يسبب تراكم البروتين أثناء التخزين. لنفس السبب، ويتم إنتاج سوى APO-RBP عالية الجودة من هولو-RBP. نحن هنا وصف بروتوكول الأمثل لانتاج عالية الجودة 100٪ RBP محملة الريتينول من خلال التعبير البكتيرية، طوي ثانية، وتنقية HPLC. HPLC تنقية ليس فقط يزيل RBP مطوية بشكل غير صحيح ولكن أيضا التلوث الجرثومي كبيرة القطع الأثرية التي يمكن أن تسبب خطورة إذا تم استخدام الممارسات التجارية التقييدية في المقايسات نقل الإشارة. وصفنا أيضا اثنين من تقنيات الرصد الحساسة في الوقت الحقيقي لدراسة الريتينول النقل STRA6. كل تقنيات تعتمد على الممارسات التجارية التقييدية ذات جودة عالية. نظرا لضيق المكان، والتقنيات الكلاسيكية المشعة فيتامين ريتينويد القاعدة والقائمة على HPLC لا وصف المقايسات امتصاص هنا.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف / المواد </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> الجوانيدين هيدروكلوريد </td><td> EMD </td><td> 5010 </td><td></td></tr><tr><td> سيستين </td><td> سيجما </td><td> C8755 </td><td></td></tr><tr><td> السيستين </td><td> سيجما </td><td> C7352 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> الصياد </td><td> BP118-500 </td><td></td></tr><tr><td> تريس </td><td> الصياد </td><td> 7786-1 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> EMD </td><td> 3860 </td><td></td></tr><tr><td> الريتينول </td><td> سيجما </td><td> R7632 </td><td></td></tr><tr><td> كربنيسيلين </td><td> الصياد </td><td> BP2648-5 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> EMD </td><td> 5810 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> EMD </td><td> 6508 </td><td></td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> الصياد </td><td> BP358-10 </td><td></td></tr><tr><td> ني NTA </td><td> QIAGEN </td><td> 1018244 </td><td></td></tr><tr><td> إيميدازول </td><td> EMD </td><td> 5720 </td><td></td></tr><tr><td> هيبتان </td><td> EMD </td><td> HX0295-1 </td><td></td></tr><tr><td> مانع الكازين </td><td> خرق </td><td> 37528 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon الترا المكثف 15 (MWCO10 K) </td><td> ميليبور </td><td> UFC901024 </td><td></td></tr><tr><td> Microfluor-2 لوحة </td><td> الصياد </td><td> 14-245-177 </td><td></td></tr><tr><td> هاميلتون حقنة Gastight # 1710 </td><td> الصياد </td><td> 14-824-655 </td><td></td></tr></tbody></table>

real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein

فيتامين A ضروري لرؤية و. النمو / التفريق بين جميع أجهزة الإنسان تقريبا الريتينول البلازما بروتين ملزمة (RBP) هو مبدأ والناقل محددة من فيتامين A في الدم. نحن هنا وصف تقنية محسنة لإنتاج وتنقية هولو-RBP واثنين من تقنيات الرصد في الوقت الحقيقي لدراسة النقل من فيتامين A من قبل مستقبلات RBP عالية تقارب STRA6. أول تقنية يجعل من الممكن لإنتاج كمية كبيرة من نوعية عالية هولو-RBP (100٪ محملة الريتينول) لفيتامين (أ) المقايسات النقل. عالية الجودة RBP أمر ضروري لفحوصات الفنية لتتجمع RBP النشرات فيتامين A تلوث بسهولة والبكتيرية في إعداد RBP يمكن أن يسبب التحف. جعلت تقنيات الرصد في الوقت الحقيقي مثل الكهربية إسهامات حاسمة في دراسات النقل الغشاء. لم يتم النقل RBP الريتينول مستقبلات بوساطة تحليلها في الوقت الحقيقي حتى وقت قريب. والأسلوب الثاني هو موضح هنا الجرميةل في الوقت تحليل الإفراج الريتينول STRA6 المحفزة أو التحميل. أسلوب الثالث هو في الوقت الحقيقي تحليل STRA6 المحفزة النقل من الريتينول هولو-RBP إلى الريتينول الخلوية I بروتين ملزمة (CRBP-I). هذه التقنيات توفر حساسية عالية في الكشف والقرار فيتامين A في RBP مستقبلات آلية الامتصاص.

نقدم نتائج ممثلة هنا للهولو-RBP إنتاج وتنقية من قبل HPLC (الشكل 1)، في الوقت الحقيقي تحليل STRA6 المحفزة الإفراج الريتينول من هولو-RBP وتحميل الريتينول إلى APO-RBP (الشكل 2) في الوقت الحقيقي وتحليل STRA6 المحفزة الريتينول النقل من هولو-RBP لEGFP-CRBP-I (الشكل 3). <...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein at JoVE.com

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

نحن هنا وصف تقنية الأمثل لإنتاج عالية الجودة فيتامين A معقدة RBP / واثنين من تقنيات الرصد في الوقت الحقيقي لدراسة فيتامين A النقل STRA6، ومستقبلات RBP.

في الوقت الحقيقي تحليلات النقل الريتينول بواسطة مستقبلات البروتين غشاء البلازما الريتينول ملزم

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

قياس معدلات بلازما بروتين الغشاء التقامي بواسطة Biotinylation عكسية

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

قياس الكمي GLUT4 إزفاء إلى غشاء البلازما التي التدفق الخلوي

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Biochemical Reconstitution of Steroid ReceptorÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â¢Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

إعادة إعماره البيوكيميائية من مستقبلات البروتين الستيرويد • المجمعات Hsp90 وإعادة تنشيط يجند تجليد

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

رسم خرائط الانتشار الجزيئي في غشاء البلازما من قبل متعددة الهدف، للبحث عن المفقودين (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

في الوقت الحقيقي رصد يجند مستقبلات التفاعل مع الإسفار نقل الطاقة الرنين

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

البروتين طريقة خالية من تنقية تجليد تحديد الانجذاب من قبل Thermophoresis الميكروسكيل

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

خلايا الثدييات إضاءة الحيوية مستقل للمراقبة المستمرة وريال مدريد في الوقت السمسة

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

التصوير البلازما غشاء التشويهات مع pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

قياسات الوقت الحقيقي من البروتين غشاء: مستقبلات التفاعلات عن طريق مأكل السطح الرنين (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...