Name: real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein
Uploaded: 2013-01-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein at JoVE.com

Støttet af National Institutes of Health tilskud R01EY018144.

1. Produktion, Refoldning, og HPLC-oprensning af holo-RBP <ol><li> Transform BL-21cells med pET3a vektor, der huser cDNA&#39;et for human RBP med 6x His-mærke på N-terminalen. Dyrke de transformerede BL-21-celler i et rysteapparat ved 37 ° C i 40 ml LB-medium med carbenicillin, indtil OD ved 600 nm når 0,5. Inducere RBP-proteinekspression ved tilsætning af IPTG til 1 mM. Dyrke bakterierne ved 37 ° C endnu 5 timer. </li><li> RBP produceret i E. coli er for det meste til stede i uopløselige inklusionsleg...

Vi deler her en optimeret RBP produktion protokol fordi RBP produktion og oprensning procedurer er afgørende for at skabe korrekt foldet RBP. Have mulighed for fejlfoldede RBP arter og tilstedeværelsen af ​​spormængder af bakterielle proteiner selv i HPLC-oprenset bakterier producerede RBP, er det nyttigt at anvende nativt RBP fra serum for at bekræfte en konklusion vedrørende RBP. Urin RBP, som er kommercielt tilgængelig, er en kompleks blanding af mange arter af RBP herunder apo-RBP-og holo-RBP 48,49.</...

Vitamin A er et organisk molekyle, der er afgørende for menneskets overlevelse og et velfungerende næsten alle menneskelige organer. Vitamin A derivater (retinoider) deltage i diverse biokemiske og cellulære begivenheder, herunder sensing af lys til syn 1,2 og reguleringen af genekspression og protein translation under fosterudviklingen og i voksent væv 3-6. Selv retinol har evnen til at diffundere systemisk, evolution kom op med plasma retinol-bindende protein, et specifikt bærerprotein for vitamin A transport i blodet for at opnå en høj effektivitet og specificitet og undgå toksicitet forbundet med tilfældig diffusion 7-10. Et højaffinitets-receptoren, som binder til RBP og fylder vitamin A Hypotesen var i 1970&#39;erne 11-13. Trods beviser akkumuleret i tre årtier på eksistensen af RBP receptor 14-31 blev receptor hypotese debatteret i mange år på grund af existence af en forkert definition af holo-RBP. Den korrekte definition af holo-RBP er, at det er den høje affinitet 1:1 kompleks mellem retinol og RBP. Gentagen ekstraktion af holo-RBP af organisk opløsningsmiddel er nødvendig til at producere Apo-RBP. Denne definition anvendes af næsten alle laboratorier studerer RBP 7,9,32-35 eller RBP-receptoren 14-31,36-42. Den forkerte definition af holo-RBP der blev brugt til modbevise eksistensen af ​​RBP-receptoren er den akutte blanding af fri retinol med apo-RBP. Eftersom funktionen af ​​RBP receptoren i vitamin A optagelse fra holo-RBP er at frigøre retinol fra holo-RBP ville RBP-receptoren spiller nogen rolle i retinol optagelse hvis retinol er fri til at begynde med (som foreslået af urigtige afgrænsning af holo -RBP). Den nylige identifikation af RBP receptor som multitransmembrane domæne protein kaldet STRA636 og dets funktion i vitamin A optagelse fra holo-RBP 36-43 kraftigt taler imod den hypotese, at RBP ikke erbrug for en receptor til at levere vitamin A. Detaljerede analyser afslørede, at STRA6 har 9 transmembrane domæner med N-terminalen er placeret ekstracellulært, og C-terminus placeret intracellulært 40. Placeret mellem transmembran 6 og 7 er en væsentlig RBP bindingsdomæne 39. STRA6 er koblet til både LRAT og CRBP-I i vitamin A optagelse fra holo-RBP, men hverken LRAT eller CRBP-I er absolut nødvendig for øget STRA6 aktivitet 41. STRA6 evne til at katalysere retinol frigivelse fra holo-RBP er nøglen til dets vitamin A optagelsesaktivitet 41. Ved at lægge STRA6 at frigive sit retinol, kan vitamin A levering af RBP transportere vitamin A til målceller i perifere væv med høj specificitet og effektivitet. Den afgørende betydning af holo-RBP definition og forberedelse illustreres ikke kun af historisk debat om eksistensen af ​​RBP-receptoren, men også af tre beslægtede seneste artikler baseret på holo-RBP definitioner DIFskellige fra den oprindelige og korrekte definition 44-46. Det første papir holo-RBP definition, der blev anvendt til at afvise eksistensen af RBP receptoren at undersøge RBP receptor 44. Den anden og tredje papirer kom op med en tredje definition af holo-RBP der gjorde det endnu mindre sandsynligt for retinol, som skal undersøges for at danne en ordentlig kompleks med RBP 45,46. Disse undersøgelser prepared 3 H-retinol/RBP ved blanding af holo-RBP (ikke engang apo-RBP) med 3H-retinol. Eftersom dette assay ikke havde 3 H-retinol/RBP dannet og ikke unødigt frit 3H-retinol 45,46, er det ikke et assay for 3H-retinol optagelse fra 3 H-retinol/RBP, men er en fri 3H-retinol diffusion assay. Det er blevet vist tidligere, at STRA6 ikke forøge cellulær optagelse af frit retinol ved LRAT 38 eller CRBP-I 41. Stort set al retinol er bundet til RBP i blodet, og der er ingen påviselig free retinol. En hovedfunktion RBP-receptoren er at katalysere retinol frigivelse fra holo-RBP under retinol optagelse fra holo-RBP 41. Hvis retinol kunstigt frigives eller er i fri form til at begynde med 45,46 er RBP-receptoren ikke nødvendigt. De dramatisk forskellige resultater, som frit retinol diffusion assay i sammenligning med assays baseret på korrekt forberedt holo-RBP illustrerer, at korrekt tilberedning af RBP er afgørende for dets funktionelle assays. RBP kan oprenses fra humant serum 41, men fremgangsmåden er kompleks, og udbyttet er lavt. En alternativ fremgangsmåde er at fremstille RBP i E. coli. Da E. coli ikke har evnen til korrekt folde mammale secernerede proteiner med mere end ét par af disulfidbindinger som RBP, er det vigtigt at refold RBP og oprense korrekt foldede protein. Fejlfoldede proteiner ikke alene opfører sig forskelligt fra korrigeret foldede RBP i forskellige analyser,men også forårsage proteinaggregering under opbevaring. Af samme grund er apo-RBP kun fremstillet af høj kvalitet holo-RBP. Vi beskriver her en optimeret protokol til at producere høj kvalitet RBP 100% fyldt med retinol gennem bakteriel ekspression, genfoldning, og HPLC-oprensning. HPLC-oprensning ikke kun fjerner ukorrekt foldet RBP men også betydelig bakteriel forurening, der kan forårsage alvorlige artefakter hvis RBP bruges i signaltransduktionsinhibitorer assays. Vi beskriver også to følsomme real-time overvågning teknikker til at studere retinol transport af STRA6. Begge teknikker afhænger af høj kvalitet RBP. På grund af pladsbegrænsninger, de klassiske teknikker til radioaktiv retinoid-baseret og HPLC-baseret vitamin A uptake assays er ikke beskrevet her.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens / Material </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> guanidinhydrochlorid </td><td> EMD </td><td> 5010 </td><td></td></tr><tr><td> cystin </td><td> Sigma </td><td> C8755 </td><td></td></tr><tr><td> cystein </td><td> Sigma </td><td> C7352 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Fisher </td><td> BP118-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tris </td><td> Fisher </td><td> 7786-1 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> EMD </td><td> 3860 </td><td></td></tr><tr><td> retinol </td><td> Sigma </td><td> R7632 </td><td></td></tr><tr><td> carbenicillin </td><td> Fisher </td><td> BP2648-5 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> EMD </td><td> 5810 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> EMD </td><td> 6508 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher </td><td> BP358-10 </td><td></td></tr><tr><td> Ni-NTA </td><td> Qiagen </td><td> 1018244 </td><td></td></tr><tr><td> imidazol </td><td> EMD </td><td> 5720 </td><td></td></tr><tr><td> heptan </td><td> EMD </td><td> HX0295-1 </td><td></td></tr><tr><td> Blocker Kasein </td><td> Pierce </td><td> 37.528 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon Ultra 15 koncentrator (MWCO10 K) </td><td> Millipore </td><td> UFC901024 </td><td></td></tr><tr><td> Mikrofluorplade-2 plade </td><td> Fisher </td><td> 14-245-177 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton-sprøjte Gastæt # 1710 </td><td> Fisher </td><td> 14-824-655 </td><td></td></tr></tbody></table>

real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein

Vitamin A er afgørende for vision og vækst / differentiering af næsten alle menneskelige organer. Plasma retinol-bindingsprotein (RBP) er princippet og specifik bærer af vitamin A i blodet. Her beskriver vi en optimeret teknik til at producere og oprense holo-RBP og to real-time overvågning teknikker til at studere transporten af ​​vitamin A ved høj affinitet RBP receptor STRA6. Den første teknik gør det muligt at fremstille en stor mængde af høj kvalitet holo-RBP (100%-fyldt med retinol) for vitamin A transport assays. Høj kvalitet RBP er afgørende for funktionelle assays, fordi fejlfoldede RBP udgivelser vitamin A let og bakteriel forurening i RBP forberedelse kan forårsage artefakter. Real-time overvågning teknikker som elektrofysiologi har gjort kritiske bidrag til studier af membran transport. Den RBP receptormedieret retinol transport er ikke blevet analyseret i realtid indtil for nylig. Den anden teknik er beskrevet her, er real-time analyse af STRA6-katalyseret retinol frigivelse eller læsning. Den tredje teknik er realtidsanalyse af STRA6-katalyseret retinol transport fra holo-RBP til cellulært retinol bindingsprotein I (CRBP-I). Disse teknikker giver høj følsomhed og opløsning i afslørende RBP receptors vitamin A optagelse mekanisme.

Vi præsenterer her repræsentative resultater for holo-RBP produktion og oprensning ved HPLC (fig. 1), real-time analyse af STRA6-katalyseret retinol frigivelse fra holo-RBP og retinol påfyldning i apo-RBP (fig. 2) og tidstro analyse af STRA6-katalyseret retinol transport fra holo-RBP til EGFP-CRBP-I (figur 3). Uden genfoldning, fremstillet RBP i bakterier er næsten fuldstændigt fejlfoldede på grund af tilstedeværelsen af ​​mange u...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein at JoVE.com

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Her beskriver vi en optimeret teknik til at producere høj kvalitet vitamin A / RBP kompleks og to real-time overvågning teknikker til at studere vitamin A transport med STRA6, det RBP receptoren.

Real-time Analyser af Retinol Transport af membranen Receptor af Plasma retinolbindingsprotein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Biochemical Reconstitution of Steroid ReceptorÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â¢Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Kortlægning af molekylær diffusion i plasmamembranen ved Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

Real-time overvågning af ligand-receptor interaktioner med Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Protein Purification-fri metode til Binding Affinity Bestemmelse ved Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Autonomt Bioluminescent pattedvrceller for vedvarende og Real-time overvågning af cytotoksicitet

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

Imaging plasmamembranen Deformations Med pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Realtidsmålinger membranprotein: Receptor Interactions Brug overfladeplasmonresonans (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grønt fluorescerende protein-baserede Expression Screening membranproteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...