Name: real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein
Uploaded: 2013-01-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein at JoVE.com

Ondersteund door National Institutes of Health subsidie ​​R01EY018144.

1. Productie, hervouwing, en HPLC zuivering van Holo-RBP <ol><li> Transformeren BL-21cells de pET3a vector die het cDNA voor menselijke RBP met 6x His tag aan de N-terminus. Groeien de getransformeerde BL-21 cellen in een shaker bij 37 ° C in 40 ml LB medium met carbenicilline tot OD bij 600 nm bereikt 0.5. RBP eiwitexpressie induceren door toevoeging IPTG tot 1 mM. De bacteriën groeien bij 37 ° C nog eens 5 uur. </li><li> RBP geproduceerd in E.coli is vooral aanwezig in onoplosbare inclusielichamen. Om in...

We delen hier een geoptimaliseerde RBP productieprotocol omdat RBP productie en zuivering procedures zijn cruciaal voor het genereren van correct gevouwen RBP. Gezien de mogelijkheid van verkeerd gevouwen RBP soorten en de aanwezigheid van sporen van bacteriële eiwitten zelfs HPLC gezuiverde bacteriën geproduceerde RBP, is het nuttig om natieve RBP gebruik van serum tot een conclusie met betrekking tot RBP bevestigen. Urine RBP, dat commercieel verkrijgbaar is, is een complex mengsel van vele soorten waaronder RBP apo...

Vitamine A is een organisch molecuul dat essentieel is voor de menselijke overleving en de goede werking van bijna alle menselijke organen. Vitamine A-derivaten (retinoïden) deel te nemen aan diverse biochemische en cellulaire evenementen, waaronder de detectie van licht voor visie 1,2 en de regulatie van genexpressie en eiwit translatie tijdens de embryonale ontwikkeling en in volwassen weefsels 3-6. Hoewel retinol heeft de mogelijkheid om systemisch verspreiden, evolutie bedacht plasma retinol-bindend eiwit, een specifieke dragereiwit voor vitamine A transport in het bloed hoge efficiëntie en specificiteit te bereiken en toxiciteit van willekeurige diffusie 7-10 vermijden. Een hoge affiniteit receptor die bindt aan RBP en neemt vitamine A hypothese is in de jaren 1970 11-13. Ondanks bewijs verzameld in drie decennia op het bestaan ​​van de RBP receptor 14-31 werd de hypothese receptor besproken vele jaren door de existence van een onjuiste definitie van holo-RBP. De correcte definitie van holo-RBP is dat de hoge affiniteit 1:1 complex tussen retinol en RBP. Herhaalde extractie van holo-RBP organisch oplosmiddel moet apo-RBP produceren. Deze definitie wordt gebruikt door bijna alle laboratoria bestuderen RBP 7,9,32-35 of de RBP-receptor 14-31,36-42. De onjuiste bepaling van holo-RBP die werd gebruikt om het bestaan ​​van de RBP receptor weerleggen de acute mengsel van vrije retinol met apo-RBP. Aangezien de functie van de receptor RBP in vitamine A opname van holo-RBP is retinol bevrijden van holo-RBP de RBP receptor zou geen rol spelen in retinol opname als retinol vrij om te beginnen (zoals voorgesteld door de onjuiste bepaling van holo -RBP). De recente identificatie van RBP receptor als multitransmembrane domein eiwit STRA636 en zijn functie in vitamine A opname van holo-RBP 36-43 sterk pleit tegen de hypothese dat niet RBPhebben een receptor aan vitamine A. Gedetailleerde analyse bleek dat STRA6 9 transmembraandomeinen de N-terminus extracellulair gelegen en C-terminus gelegen intracellulair 40 moet leveren. Gelegen tussen transmembraan 6 en 7 is een essentieel RBP bindend domein 39. STRA6 is gekoppeld aan zowel LRAT en CRBP-I in vitamine A opname van holo-RBP, maar noch LRAT noch CRBP-I is absoluut noodzakelijk voor een betere STRA6 activiteit 41. STRA6&#39;s vermogen om retinol vrijkomen katalyseren van holo-RBP is de sleutel tot de vitamine A-opname-activiteit 41. Door te vertrouwen op STRA6 zijn vrij retinol, vitamine A bezorging RBP transporteren vitamine A doelcellen in perifere weefsels met hoge specificiteit en efficiëntie. De kritische belang van holo-RBP definitie en bereiding wordt geïllustreerd door niet alleen de historische discussie over het bestaan ​​van de RBP receptor, maar ook door drie verbonden recente artikelen op basis van holo-RBP definities diflende van het origineel en correcte definitie 44-46. De eerste papier de holo-RBP definitie die werd gebruikt om het bestaan ​​van de RBP receptor de receptor bestuderen RBP 44 afkeuren. De tweede en derde papers kwam met een derde definitie holo-RBP dat het nog minder waarschijnlijk retinol worden bestudeerd om een goede complex met RBP 45,46 vormen. Deze studies bereid door mengen van drie H-retinol/RBP holo-RBP (zelfs apo-RBP) met 3 H-retinol. Aangezien deze test niet hebben 3 H-retinol/RBP gevormd en verwijderde niet buitensporige vrije 3H-retinol 45,46 is geen test voor 3H-retinol opname van 3 H-retinol/RBP, maar is een vrije 3H-retinol diffusie assay. Eerder is aangetoond dat STRA6 geen cellulaire opname van vrije retinol verbeteren door LRAT 38 of CRBP-I 41. Vrijwel alle retinol is gebonden aan RBP in het bloed en er geen detecteerbare free retinol. Een van de belangrijkste functie van de RBP-receptor is retinol vrijkomen katalyseren van holo-RBP tijdens retinol opname van holo-RBP 41. Als de retinol kunstmatig model of in vrije vorm te beginnen 45,46 wordt het RBP receptor niet nodig. De sterk verschillende resultaten van de vrije diffusie retinol assay ten opzichte van assays gebaseerd op kunnen bereid holo-RBP illustreren dat correcte voorbehandeling van RBP is cruciaal voor de functionele assays. RBP kan worden gezuiverd uit humaan serum 41, maar is complex en de opbrengst is laag. Een alternatieve benadering is om RBP produceren in E. coli. Omdat E. coli niet de mogelijkheid kunnen zoogdieren uitgescheiden eiwitten vouwen met meer dan een paar disulfidebindingen zoals RBP, is het essentieel om refold RBP en correct gevouwen eiwit te zuiveren. Verkeerd gevouwen eiwitten niet alleen gedragen zich anders uit gecorrigeerde gevouwen RBP in verschillende assays,maar ook tot eiwitaggregatie tijdens opslag. Om dezelfde reden wordt apo-RBP alleen geproduceerd uit hoogwaardig holo-RBP. We beschrijven hier een geoptimaliseerd protocol van hoge kwaliteit te produceren RBP 100% geladen met retinol door bacteriële expressie, hervouwing, en HPLC zuivering. HPLC zuivering verwijdert niet alleen verkeerd gevouwen RBP, maar ook belangrijke bacteriële besmetting die kan leiden tot ernstige artefacten als RBP wordt gebruikt in signaaltransductie assays. We beschrijven ook twee gevoelige real-time monitoring technieken om retinol vervoer bestuderen door STRA6. Beide technieken zijn afhankelijk van hoge kwaliteit RBP. Vanwege de beperkte ruimte, de klassieke technieken van radioactieve retinoïde-based en HPLC-gebaseerde vitamine A opname testen worden hier niet beschreven.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Materiaal </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> guanidine hydrochloride </td><td> EMD </td><td> 5010 </td><td></td></tr><tr><td> cystine </td><td> Sigma </td><td> C8755 </td><td></td></tr><tr><td> cysteïne </td><td> Sigma </td><td> C7352 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Visser </td><td> BP118-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tris </td><td> Visser </td><td> 7,786-1 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> EMD </td><td> 3860 </td><td></td></tr><tr><td> retinol </td><td> Sigma </td><td> R7632 </td><td></td></tr><tr><td> carbenicilline </td><td> Visser </td><td> BP2648-5 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> EMD </td><td> 5810 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> EMD </td><td> 6508 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Visser </td><td> BP358-10 </td><td></td></tr><tr><td> Ni-NTA </td><td> Qiagen </td><td> 1018244 </td><td></td></tr><tr><td> imidazol </td><td> EMD </td><td> 5720 </td><td></td></tr><tr><td> heptane </td><td> EMD </td><td> HX0295-1 </td><td></td></tr><tr><td> Blocker Caseïne </td><td> Doorboren </td><td> 37528 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO10 K) </td><td> Millipore </td><td> UFC901024 </td><td></td></tr><tr><td> Microfluor-2 plaat </td><td> Visser </td><td> 14-245-177 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton spuit Gasdichte # 1710 </td><td> Visser </td><td> 14-824-655 </td><td></td></tr></tbody></table>

real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein

Vitamine A is essentieel voor het gezichtsvermogen en de groei / differentiatie van bijna alle menselijke organen. Plasma retinol-bindend eiwit (RBP) is het principe en specifieke drager van vitamine A in het bloed. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde techniek te produceren en te zuiveren holo-RBP en twee real-time monitoring technieken om het vervoer van vitamine A door de hoge-affiniteit RBP receptor STRA6 bestuderen. De eerste techniek is het mogelijk om een ​​grote hoeveelheid hoge kwaliteit holo-RBP (100% geladen met retinol) voor vitamine A transport assays. Hoge kwaliteit RBP is essentieel voor functionele testen, omdat verkeerd gevouwen RBP releases vitamine A gemakkelijk en bacteriële besmetting in RBP voorbereiding kan leiden tot artefacten. Real-time monitoring technieken zoals elektrofysiologie zijn kritische bijdragen geleverd tot de studies van membraan transport. De RBP-receptor-gemedieerde retinol vervoer niet is geanalyseerd in real time tot voor kort. De tweede techniek is de hier beschreven real-time analyse van STRA6 gekatalyseerde retinol release of laden. De derde techniek is real-time analyse van STRA6 gekatalyseerde retinol transport van holo-RBP om cellulaire retinol-bindend eiwit I (CRBP-I). Deze technieken zorgen voor een hoge gevoeligheid en resolutie in het onthullen van RBP receptor vitamine A opname mechanisme.

We stellen hier representatieve resultaten voor holo-RBP productie en zuivering door HPLC (figuur 1), real-time analyse van STRA6 gekatalyseerde retinol afgifte van holo-RBP en retinol lading in apo-RBP (Figuur 2) en real-time analyse van STRA6 gekatalyseerde retinol transport van holo-RBP om EGFP-CRBP-I (Figuur 3). Zonder hervouwing, RBP geproduceerd in bacteriën bijna volledig door de aanwezigheid van veel onjuiste disulfide bindingen ver...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein at JoVE.com

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde techniek om hoogwaardige vitamine A / RBP complex en twee real-time monitoring technieken om studeren vitamine A het vervoer door STRA6, de RBP-receptor te produceren.

Real-time analyses van Retinol Vervoer door de membraan receptor van Plasma Retinol bindend eiwit

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Het meten van plasma membraaneiwit endocytische de tarieven door Omkeerbare biotinylatie

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Kwantitatieve meting van GLUT4 translocatie naar de plasmamembraan door middel van flowcytometrie

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Biochemical Reconstitution of Steroid ReceptorÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â¢Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Biochemische Reconstitutie van Steroid Receptor • Hsp90 eiwitcomplexen en reactivering van Ligand binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Het in kaart brengen moleculaire diffusie in het plasmamembraan door Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

Real-time monitoring van ligand-receptor interacties met Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Eiwitzuivering-vrij bindwijze affiniteit Bepaling door Microschaal thermophoresis

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Autonoom Bioluminescente zoogdiercellen voor continue en real-time monitoring van de cytotoxiciteit

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

Imaging Plasma Membraan Vervormingen Met pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Real Time Metingen van membraaneiwit: Receptor Interacties gebruik Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein gebaseerd Expression Screening van membraaneiwitten in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...