Name: real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein
Uploaded: 2013-01-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein at JoVE.com

נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות המענק R01EY018144.

1. ייצור, מקפלים, וטיהור HPLC של הולו-RBP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את BL-21cells עם וקטור pET3a מחסה cDNA לRBP האנושי עם 6x התג שלו על N-הסופי. לגדל את BL-21 התאים הפכו בייקר על 37 מעלות צלזיוס בתקשורת 40 מ&quot;ל LB עם carbenicillin עד OD ב 600 ננומטר מגיע 0.5. לגרום ביטוי חלבו...

אנו חולקים כאן פרוטוקול ייצור RBP אופטימלי בגלל תהליכי ייצור וטיהור RBP הם קריטיים ליצירת RBP מקופל בצורה נכונה. בהתחשב באפשרות של מיני RBP misfolded והנוכחות של כמויות זעירות של חלבונים חיידקיים אפילו בHPLC המטוהר חיידקים מיוצרים RBP, כדאי להשתמש RBP יליד מסרום כדי לאשר מסקנה הקשו...

ויטמין A היא מולקולה אורגנית שהיא חיוני להישרדות אנושית ותפקוד התקין של כמעט כל איברי האדם. ויטמין נגזר (רטינואידים) להשתתף באירועים ביוכימיים וסלולריים מגוונים כולל את החישה של אור ל1,2 חזון והרגולציה של ביטוי גנים ותרגום חלבונים במהלך התפתחות עוברית וברקמות בוגרות 3-6. למרות רטינול יש את היכולת לפזר מערכתי, האבולוציה באה עם חלבון פלזמת רטינול מחייב, חלבון נישא ספציפי לויטמין תחבורה בדם כדי להשיג יעילות וסגולית גבוהה ולהימנע מרעילויות קשורות דיפוזיה 7-10 אקראית. קולטן זיקה גבוהה שנקשר לRBP ולוקח ויטמין היה שיערות ב1970 11-13. למרות ראיות שהצטברו בשלושה עשורים על קיומו של הקולטן RBP 14-31, השערת הקולט נדונה במשך שנים רבות בשל existencדואר של הגדרה לא נכונה של הולוגרמות RBP. ההגדרה הנכונה של הולוגרמות RBP היא שזה מורכב 01:01 זיקה הגבוהה בין רטינול וRBP. שאיבה חוזרת של הולוגרמות RBP ידי ממס אורגני היא הכרחית כדי לייצר apo-RBP. הגדרה זו משמשת כמעט על ידי כל המעבדות הלומדות RBP 7,9,32-35 או קולט RBP 14-31,36-42. ההגדרה לא הנכונה של הולוגרמות RBP ששמשה להפריך את קיומו של הקולטן RBP היא התערובת החריפה של רטינול החופשי עם apo-RBP. מאז הפונקציה של הקולטן RBP בויטמין ספיגה מהולוגרמות RBP היא לשחרר רטינול מהולוגרמות RBP, קולט RBP היה לשחק שום תפקיד בספיגת רטינול אם רטינול הוא חופשי להתחיל עם (כפי שהוצע על ידי ההגדרה הנכונה של הולו RBP-). זיהוי האחרון של הקולטן RBP כחלבון תחום multitransmembrane נקרא STRA636 ותפקודו בספיגת הוויטמין מהולוגרמות RBP 36-43 חזקה טוען נגד ההשערה כי RBP לאצריך קולט לספק ניתוחים מדוקדקים ויטמין A. נמצאו כי STRA6 יש 9 תחומים הטרנסממברני עם N-הסופי ממוקמים extracellularly וC-Terminus ממוקמים intracellularly 40. ממוקם בין הטרנסממברני 6 ו 7 הוא תחום מחייב חיוני RBP 39. STRA6 מצמיד הן LRAT וCRBP-אני בויטמין ספיגה מהולוגרמות RBP, אך גם לא LRAT CRBP-אני דרוש לחלוטין לSTRA6 פעילות מוגברת 41. היכולת של STRA6 לזרז שחרור רטינול מהולוגרמות RBP היא המפתח לויטמינה פעילות ספיגה 41. על ידי הסתמכות על STRA6 לשחרר רטינול, ויטמין מסירה בRBP יכול להסיע ויטמין למקד את התאים ברקמות פריפריה עם סגוליות גבוהות ויעילות. החשיבות הקריטית של הגדרת הולוגרמות RBP והכנה מודגמת לא רק הדיון ההסטורי על קיומו של הקולטן RBP, אלא גם על ידי שלושה עיתונים האחרונים הבוסס על הולוגרמות RBP אונטערשייד הגדרותשונה שמפה מהגדרה המקורית ונכונה 44-46. העיתון הראשון השתמש בהגדרת הולוגרמות RBP ששמשה לפסול את קיומו של הקולטן RBP ללמוד RBP קולט 44. את המסמכים השניים ושלישיים באו עם הגדרה שלישית של הולוגרמות RBP שעשתה את זה אפילו פחות סביר לרטינול להיחקר כדי ליצור מורכבות נכונות עם RBP 45,46. מחקרים אלה הוכנו על ידי ערבוב 3 H-retinol/RBP הולוגרמות RBP (אפילו לא apo-RBP) עם 3 H-רטינול. מאז assay זה לא היה לי 3 H-retinol/RBP נוצר ולא להסיר המוגזם חופשי 3 H-רטינול 45,46, זה לא assay לספיגת H-3 מ 3 H-retinol/RBP רטינול, אבל הוא חופשי 3 assay דיפוזיה H-רטינול. זה כבר הראה בעבר כי STRA6 לא לשפר את ספיגת הסלולר של רטינול בחינם על ידי LRAT 38 או CRBP-41. כמעט כל רטינול חייב RBP בדם ואין להבחין freהדואר רטינול. פונקציה עיקרית של הקולטן RBP היא לזרז שחרור רטינול מהולוגרמות RBP במהלך ספיגת רטינול מהולוגרמות RBP 41. אם רטינול הוא שוחרר באופן מלאכותי, או בצורה החופשית להתחיל עם 45,46, קולט RBP אין צורך. התוצאות השונות באופן דרמטי המתקבלות מבדיקת דיפוזיה רטינול החופשית בהשוואה למבחנים הבוסס על הוכן כראוי הולוגרמות RBP להמחיש כי הכנה הנכונה של RBP הן קריטיות עבור המבחנים הפונקציונליים שלו. RBP יכול להיות מטוהר מסרום האדם 41, אך ההליך מורכב והתשואה היא נמוכה. גישה חלופית היא לייצר RBP בE. coli. בגלל E. coli אין יכולת כראוי לקפל חלבונים מופרשים יונקים עם יותר מזוג אחד של אג&quot;ח דיסולפיד כמו RBP, זה חיוני כדי לקפל RBP ולטהר את החלבון המקופל בצורה נכונה. חלבוני Misfolded לא מתנהגים בצורה שונה מרק RBP המקופל תוקן במבחנים שונים,אבל גם לגרום להצטברות חלבון במהלך האחסון. מאותה הסיבה, apo-RBP מיוצר רק מהאיכות גבוהה הולוגרמות RBP. אנו מתארים כאן פרוטוקול אופטימלי לייצר RBP איכות גבוהה 100% עמוסים רטינול דרך ביטוי חיידקים, מקפל, וטיהור HPLC. טיהור HPLC מסירה RBP מקופל באופן שגוי, אלא גם זיהום חיידקים משמעותי שיכול לגרום לממצאים חמורים אם RBP משמש במבחני העברת אותות לא רק. גם אנו מתארים שתי טכניקות בזמן אמת ניטור רגישים ללמוד תחבורת רטינול ידי STRA6. שני הטכניקות תלויות בRBP באיכות גבוהה. בשל מגבלות מקום, בטכניקות הקלסיות של ויטמין retinoid מבוסס וHPLC מבוסס רדיואקטיבי A מבחני ספיגה אינן מתוארות כאן.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> hydrochloride guanidine </td><td> EMD </td><td> 5010 </td><td></td></tr><tr><td> ציסטין </td><td> סיגמא </td><td> C8755 </td><td></td></tr><tr><td> ציסטאין </td><td> סיגמא </td><td> C7352 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> דיג </td><td> BP118-500 </td><td></td></tr><tr><td> טריס </td><td> דיג </td><td> 7786-1 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> EMD </td><td> 3860 </td><td></td></tr><tr><td> רטינול </td><td> סיגמא </td><td> R7632 </td><td></td></tr><tr><td> carbenicillin </td><td> דיג </td><td> BP2648-5 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> EMD </td><td> 5810 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> EMD </td><td> 6508 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> דיג </td><td> BP358-10 </td><td></td></tr><tr><td> Ni-נ.ת. ע </td><td> Qiagen </td><td> 1018244 </td><td></td></tr><tr><td> imidazole </td><td> EMD </td><td> 5720 </td><td></td></tr><tr><td> heptane </td><td> EMD </td><td> HX0295-1 </td><td></td></tr><tr><td> החוסם קזאין </td><td> לנקב </td><td> 37528 </td><td></td></tr><tr><td> 15 concentrator Ultra Amicon (MWCO10 K) </td><td> Millipore </td><td> UFC901024 </td><td></td></tr><tr><td> Microfluor-2 צלחת </td><td> דיג </td><td> 14-245-177 </td><td></td></tr><tr><td> המילטון המזרק Gastight # 1710 </td><td> דיג </td><td> 14-824-655 </td><td></td></tr></tbody></table>

real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein

ויטמין A חיונית לראייה וגדילה / התמיינות של כמעט כל איברי האדם. החלבון מחייב רטינול פלזמה (RBP) הוא עקרוני ומוביל ספציפי של ויטמין בדם. כאן אנו מתארים טכניקת אופטימיזציה לייצר ולטהר הולוגרמות RBP ושתי טכניקות ניטור בזמן אמת כדי ללמוד את ההובלה של ויטמין על ידי הקולטן גבוהה זיקת RBP STRA6. הטכניקה הראשונה מאפשרת לייצר כמות גדולה באיכות גבוהה הולוגרמות RBP (100% טיעון עם רטינול) לויטמין A מבחני תחבורה. RBP איכות הגבוהה הוא חיוני למבחנים תפקודיים בגלל misfolded RBP משחרר ויטמין זיהום חיידקים בקלות והכנת RBP יכול לגרום לחפצים. טכניקות ניטור בזמן אמת כמו electrophysiology תרמו תרומה מכרעת למחקרים של תחבורת קרום. תחבורת רטינול הקולטן בתיווך RBP לא נתח בזמן אמת עד לאחרונה. הטכניקה השנייה שתוארה כאן היא פליליתניתוח L-עת שחרור STRA6-קטליזאטור רטינול או הטעינה. השיטה השלישית היא ניתוח בזמן אמת של STRA6-קטליזאטור תחבורת רטינול מהולוגרמות RBP לסלולרי רטינול חלבון אני מחייב (CRBP-I). טכניקות אלה מספקות רגישות ורזולוציה גבוהה בחשיפת מנגנון ספיגת הוויטמין של הקולטן RBP.

אנו מציגים כאן תוצאות יציגות לייצור הולוגרמות RBP וטיהור על ידי HPLC (איור 1), ניתוח בזמן האמת של STRA6-קטליזאטור שחרור רטינול מהולוגרמות RBP וטעינת רטינול לapo-RBP (איור 2) והניתוח בזמן אמת של תחבורת STRA6-קטליזאטור רטינול מהולוגרמות RBP לEGFP-CRBP-I (איור 3). ...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein at JoVE.com

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

כאן אנו מתארים טכניקה אופטימלית לייצור ויטמין איכותי מורכב / RBP ושתי טכניקות ניטור בזמן אמת כדי ללמוד ויטמין הובלה בSTRA6, קולט RBP.

ניתוח בזמן אמת של תעבורת רטינול ידי הקולטן ממברנה של חלבון מחייב פלזמת רטינול

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

מדידת חלבון ממברנה פלזמה חליפין Endocytic ידי Biotinylation הפיך

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

מדידה כמותית של טרנסלוקציה GLUT4 על קרום התא על ידי זרימת cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Biochemical Reconstitution of Steroid ReceptorÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â¢Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

הכינון ביוכימיים של קולטן סטרואידים • Hsp90 קומפלקסים חלבונים ו מחדש של ליגנד הכבילה

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

מיפוי דיפוזיה מולקולרית בקרום פלזמה ידי מרובות יעד Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

ניטור בזמן אמת של אינטראקציות יגנד רצפטור עם פלואורסצנטי תהודת העברת אנרגיה

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

שיטה ללא טיהור חלבונים של קביעת זיקה מחייבת ידי thermophoresis Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

תאי יונקים האוטונומיים bioluminescent לניטור רציף וזמן אמת של Cytotoxicity

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

הדמיה פלזמה ממברנה עיוותים עם pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

מדידות בזמן אמת של חלבון ממברנה: קולט אינטראקציות שימוש תהודה Plasmon Surface (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...