Name: real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein
Uploaded: 2013-01-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein at JoVE.com

Støttet av National Institutes of Health tilskudd R01EY018144.

1. Produksjon, refolding, og HPLC rensing av Holo-RBP <ol><li> Transform BL-21cells med pET3a vektor harboring cDNA for menneskelig RBP med 6x Hans koden på N-terminus. Dyrke transformerte BL-21 celler i en risteapparat ved 37 ° C i 40 ml LB-medium med Carbenicillin inntil OD ved 600 nm når 0,5. Indusere RBP protein uttrykk ved å legge IPTG til 1mm. Dyrke bakterier ved 37 ° C ytterligere 5 hr. </li><li> RBP produsert i E.coli er mest til stede i uløselige inkludering organer. Å berike inkludering organ...

Vi deler her en optimalisert RBP produksjon protokoll fordi RBP produksjon og rensing prosedyrer er avgjørende for å generere riktig brettet RBP. Gitt muligheten for misfolded RBP arter og tilstedeværelsen av spormengder av bakterielle proteiner selv i HPLC renset bakterier produserte RBP, er det nyttig å bruke innfødt RBP fra serum å bekrefte en konklusjon relatert til RBP. Urin RBP, som er kommersielt tilgjengelig, er en kompleks blanding av mange arter av RBP inkludert apo-RBP og holo-RBP 48,49. ...

Vitamin A er en organisk molekyl som er avgjørende for menneskers overlevelse og riktig funksjon av nesten alle menneskelige organer. Vitamin A derivater (retinoider) deltar i ulike biokjemiske og cellulære hendelser inkludert sensing av lys for syn 1,2 og regulering av genuttrykk og protein oversettelse under embryonal utvikling og hos voksne vev 3-6. Selv retinol har evnen til å diffundere systemisk, kom evolusjon opp med plasma retinol bindende protein, en spesifikk bærerprotein for vitamin A transport i blodet for å oppnå høy effektivitet og spesifisitet og unngå toksisitet forbundet med tilfeldig diffusjon 7-10. En høy affinitet reseptor som binder seg til RBP og tar opp vitamin A ble antatt i 1970 11-13. Tross for bevis akkumulert i tre tiår på eksistensen av RBP reseptor 14-31, ble reseptoren hypotesen debattert i mange år på grunn av den existence av feil definisjon av holo-RBP. Den korrekte definisjonen av holo-RBP er at det er den høye affinitet 01:01 kompleks mellom retinol og RBP. Gjentatt ekstraksjon av holo-RBP av organisk oppløsningsmiddel er nødvendig for å produsere apo-RBP. Denne definisjonen brukes av nesten alle laboratorier studerer RBP 7,9,32-35 eller RBP reseptoren 14-31,36-42. Den ukorrekte definisjonen av holo-RBP som ble brukt til å avkrefte eksistensen av RBP reseptoren er den akutte blanding av fri retinol med apo-RBP. Siden funksjonen til RBP reseptor i vitamin A opptak fra holo-RBP er å frigjøre retinol fra holo-RBP, ville RBP reseptoren spiller ingen rolle i retinol opptak hvis retinol er fritt til å begynne med (som foreslått av feil definisjonen av holo -RBP). Den nylige identifikasjonen av RBP reseptor som multitransmembrane domene protein kalt STRA636 og dens funksjon i vitamin A opptak fra Holo-RBP 36-43 sterkt argumenterer mot hypotesen om at RBP ikketrenger en reseptor for å levere vitamin A. Detaljerte analyser avslørte at STRA6 har 9 transmembrane domener med N-terminus plassert ekstracellulært og C-terminus lokalisert intracellulært 40. Ligger mellom transmembran 6 og 7 er en essensiell RBP bindende domene 39. STRA6 er koblet til både LRAT og CRBP-I i vitamin A opptak fra Holo-RBP, men verken LRAT eller CRBP-I er absolutt nødvendig for bedre STRA6 aktivitet 41. STRA6 evne til å katalysere retinol utgivelse fra holo-RBP er nøkkelen til sitt vitamin A opptak aktivitet 41. Ved å stole på STRA6 å slippe sin retinol, vitamin A levering av RBP transportere vitamin A til målceller i perifere vev med høy spesifisitet og effektivitet. Den kritiske viktigheten av holo-RBP definisjon og forberedelse er illustrert ikke bare av historisk debatt om eksistensen av RBP reseptoren, men også av tre beslektede siste papirene basert på holo-RBP definisjoner difskjellige fra den opprinnelige og riktige definisjonen 44-46. Den første papiret brukte holo-RBP definisjon som ble brukt til å godkjenne eksistensen av RBP reseptoren å studere RBP reseptoren 44. Den andre og tredje papirer kom opp med en tredje definisjon av holo-RBP som gjorde det enda mindre sannsynlig for retinol å bli undersøkt for å danne en skikkelig kompleks med RBP 45,46. Disse studiene fremstilles 3 H-retinol/RBP ved blanding holo-RBP (ikke engang apo-RBP) med 3 H-retinol. Siden denne analysen ikke har 3 H-retinol/RBP dannet og ikke fjerne overdreven frie 3 H-retinol 45,46, er det ikke en assay for 3H-retinol opptak fra 3 H-retinol/RBP, men er en fri 3 H-retinol diffusjon analysen. Det har blitt vist tidligere at STRA6 ikke forbedre cellulært opptak av fritt retinol etter LRAT 38 eller CRBP-I 41. Nesten all retinol er bundet til RBP i blodet, og det er ingen påviselig free retinol. En hovedfunksjon RBP reseptoren er å katalysere retinol utgivelse fra Holo-RBP under retinol opptak fra Holo-RBP 41. Dersom retinol er kunstig frigis eller er i fri form til å begynne med 45,46, er RBP reseptoren ikke nødvendig. De dramatisk forskjellige resultater innhentet fra gratis retinol diffusjon analysen i forhold til analyser basert på riktig forberedt holo-RBP illustrere at riktig tilberedning av RBP er avgjørende for sine funksjonelle analyser. RBP kan bli renset fra humant serum 41, men prosedyren er kompleks og utbyttet er lavt. En alternativ tilnærming er å produsere RBP i E. coli. Fordi E. coli har ikke evnen til å fullstendig folde pattedyr utskilte proteiner med mer enn ett par av disulfidbindinger som RBP, er det viktig å refold RBP og rense fullstendig foldet protein. Misfolded proteiner ikke bare oppfører seg annerledes enn korrigert brettet RBP i ulike analyser,men også forårsake proteinaggregering under lagring. Av samme grunn er apo-RBP bare produsert av høy kvalitet holo-RBP. Vi beskriver her en optimalisert protokoll for å produsere høy kvalitet RBP 100% lastet med retinol gjennom bakteriell uttrykk, refolding, og HPLC rensing. HPLC-rensing ikke bare fjerner feil foldet RBP men også betydelig bakteriell forurensning som kan forårsake alvorlige gjenstander hvis RBP brukes i signaltransduksjon analyser. Vi beskriver også to sensitive sanntidsovervåkingssystemer teknikker for å studere retinol transport av STRA6. Begge teknikkene avhenge av høy kvalitet RBP. På grunn av plassbegrensninger, de klassiske teknikker for radioaktivt retinoid-baserte og HPLC-baserte vitamin A opptak analysene ikke er beskrevet her.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens / Material </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> guanidin hydroklorid </td><td> EMD </td><td> 5010 </td><td></td></tr><tr><td> cystin </td><td> Sigma </td><td> C8755 </td><td></td></tr><tr><td> cystein </td><td> Sigma </td><td> C7352 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Fisher </td><td> BP118-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tris </td><td> Fisher </td><td> 7786-1 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> EMD </td><td> 3860 </td><td></td></tr><tr><td> retinol </td><td> Sigma </td><td> R7632 </td><td></td></tr><tr><td> Carbenicillin </td><td> Fisher </td><td> BP2648-5 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> EMD </td><td> 5810 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> EMD </td><td> 6508 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher </td><td> BP358-10 </td><td></td></tr><tr><td> Ni-NTA </td><td> Qiagen </td><td> 1018244 </td><td></td></tr><tr><td> imidazole </td><td> EMD </td><td> 5720 </td><td></td></tr><tr><td> heptan </td><td> EMD </td><td> HX0295-1 </td><td></td></tr><tr><td> Blocker Kasein </td><td> Pierce </td><td> 37528 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon Ultra 15 konsentrator (MWCO10 K) </td><td> Millipore </td><td> UFC901024 </td><td></td></tr><tr><td> Microfluor-2 plate </td><td> Fisher </td><td> 14-245-177 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton sprøyte gasstett # 1710 </td><td> Fisher </td><td> 14-824-655 </td><td></td></tr></tbody></table>

real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein

Vitamin A er essensielt for visjonen og vekst / differensiering av nesten alle menneskelige organer. Plasma retinol bindende protein (RBP) er prinsippet og bestemt transportør av vitamin A i blodet. Her beskriver vi en optimalisert teknikk for å produsere og rense holo-RBP og to sanntidsovervåkingssystemer teknikker for å studere transport av vitamin A ved høy affinitet RBP reseptor STRA6. Den første teknikken gjør det mulig å produsere en stor mengde av høykvalitets holo-RBP (100%-lastet med retinol) for vitamin A transport-analyser. Høy kvalitet RBP er avgjørende for funksjonelle analyser fordi misfolded RBP utgivelser vitamin A lett og bakteriell forurensning i RBP forberedelse kan forårsake artefakter. Sanntidsovervåking teknikker som elektrofysiologi har gjort kritiske bidrag til studier av membran transport. Den RBP reseptor-mediert retinol transport har ikke blitt analysert i sanntid inntil nylig. Den andre teknikken beskrevet her er real-time analyse av STRA6-katalysert retinol utgivelse eller lasting. Den tredje teknikk er real-time analyse av STRA6-katalysert retinol transport fra Holo-RBP til mobilnettet retinol bindende protein I (CRBP-I). Disse teknikkene gir høy følsomhet og oppløsning i avslørende RBP reseptor er vitamin A opptak mekanisme.

Vi presenterer her representative resultater for Holo-RBP produksjon og rensing av HPLC (figur 1), real-time analyse av STRA6-katalysert retinol utgivelse fra Holo-RBP og retinol lasting i apo-RBP (figur 2) og real-time analyse av STRA6-katalysert retinol transport fra Holo-RBP til EGFP-CRBP-I (figur 3). Uten refolding, produsert RBP i bakterier er nesten helt misfolded grunnet tilstedeværelsen av mange uriktige disulfidbindinger. Derfor, r...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein at JoVE.com

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Her beskriver vi en optimalisert teknikk for å produsere høy kvalitet vitamin A / RBP kompleks og to sanntidsovervåkingssystemer teknikker for å studere vitamin A transport av STRA6, den RBP reseptoren.

Real-time analyser av Retinol Transport av membranen Receptor av Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Biochemical Reconstitution of Steroid ReceptorÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â¢Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Kartlegging Molekylær Diffusion i plasmamembranen ved Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

Real-time overvåkning av Ligand-reseptor interaksjoner med Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Protein Rensing-fri metode for Binding Affinity Fastsettelse av mikroskala Thermophoresis

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Autonomt Bioluminescent mammalieceller for Kontinuerlig og sanntids overvåking av Cytotoksisitet

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

Imaging Plasma Membran Deformasjoner Med pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Real Time Målinger av Membrane Protein: Receptor Interaksjoner Bruke Surface plasmonresonans (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grønn Fluorescent Protein-baserte Expression Screening av membran proteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...