Name: real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein
Uploaded: 2013-01-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein at JoVE.com

Поддержка Национального института здоровья грант R01EY018144.

1. Производство, складывая и ВЭЖХ очистки Холо-RBP <ol><li> Преобразование BL-21cells с вектором рЕТ3а несущие кДНК человека RBP с 6-кратным теги Его на N-конце. Расти превращается BL-21 клеток в шейкере при 37 ° С в 40 мл LB среды с карбенициллин до OD при 600 нм достигает 0,5. Вызвать RBP экспрессии белка путем д...

Мы разделяем здесь оптимизированный протокол производство ОДП, потому что RBP производства и очистки имеют решающее значение для создания правильно сложить ОДП. Учитывая возможность неправильно свернутых видов ОДП и наличие следовых количеств бактериальных белков даже в ВЭЖХ очищенн...

Витамин А является органической молекулой, которая необходима для выживания человека и надлежащее функционирование практически всех органов человека. Производные витамина А (ретиноиды) участвовать в разнообразных биохимических и клеточных событий, в том числе датчиков света за 1,2 видение и регуляции экспрессии генов и белков перевода во время эмбрионального развития и в тканях взрослого 3-6. Несмотря на то, ретинол обладает способностью диффундировать системно, эволюция придумала плазмы ретинол связывающий белок, специфический белок-носитель витамина транспорта в крови для достижения высокой эффективности и специфичности и, чтобы избежать токсичности, связанной со случайным диффузии 7-10. Высокое сродство рецептора, который связывается с ОДП и занимает витамин Была выдвинута гипотеза, в 1970-х годах 11-13. Несмотря на фактических данных, накопленных в течение трех десятилетий о существовании рецепторов RBP 14-31, рецептор гипотеза обсуждалась в течение многих лет из-за existencе неправильное определение голо-РСБ. Правильное определение голо-РСБ является то, что высокое сродство комплекса 1:1 между ретинолом и ОДП. Повторное извлечение голо-RBP органических растворителей необходимо производить апо-РСБ. Это определение используется почти во всех лабораториях изучения RBP 7,9,32-35 или рецептора RBP 14-31,36-42. Неверное определение голо-РСБ, который был использован, чтобы опровергнуть существование рецепторов КПБ является острая смесь свободного ретинола с апо-РСБ. Поскольку функция RBP рецептора витамина поглощения от голо-РСБ является освобождение ретинола от голо-РСБ, рецептор RBP будет играть никакой роли в ретинол поглощения, если ретинол является бесплатным для начала (как это было предложено неправильное определение голо -RBP). Последнее определение RBP рецептора белка домена multitransmembrane называется STRA636 и его функции витамина поглощения от голо-RBP 36-43 решительно выступает против гипотезы, что RBP ненужно рецепторов для доставки витамина А. Подробный анализ показал, что STRA6 имеет 9 трансмембранных доменов с N-конца расположены внеклеточно и С-концом расположена внутриклеточно 40. Расположенный между трансмембранными 6 и 7 является одним из важнейших RBP связывающий домен 39. STRA6 соединен с обеих LRAT и CRBP-I в витамин А поглощение от голо-РСБ, но ни LRAT ни CRBP-я абсолютно необходима для повышения STRA6 деятельности 41. Способность STRA6 по активизации ретинол освобождение от голо-РСБ является ключом к ее поглощению витаминов деятельности 41. Опираясь на STRA6 выпустить свой ретинол, витамины доставки RBP может транспортировать витамин А к клеткам-мишеням в периферических тканях с высокой специфичностью и эффективностью. Решающее значение голо-RBP определению и подготовке иллюстрируется не только исторические дебаты о существовании рецепторов КПБ, но и трех связанных с недавних работ на основе голо-RBP определения различотличный от оригинала и правильное определение 44-46. В первом документе использованы голо-RBP определение, которое было использовано для одобряют существование RBP рецепторов для изучения рецепторов RBP 44. Вторая и третья работы придумали третье определение голо-РСБ, что сделало его еще менее вероятно, для ретинола должны быть изучены, чтобы сформировать правильный комплекс с ОДП 45,46. Эти исследования подготовлены 3 H-retinol/RBP путем смешивания голо-RBP (даже не апо-РСБ) с 3 H-ретинол. С этого анализа не есть 3 H-retinol/RBP сформирован и не снять излишнее бесплатно 3 H-ретинол 45,46, это не тест для 3 H-ретинол поглощения от 3 ​​H-retinol/RBP, но это бесплатный 3 H-ретинол диффузии анализа. Было показано ранее, что STRA6 не увеличивает поглощение клетками свободного ретинола по LRAT 38 или CRBP-I 41. Практически все ретинола связана с ОДП в крови, и нет обнаруживаемых частотыэлектронной ретинола. Основной функцией рецептора RBP является ускорение ретинол освобождение от голо-РСБ во время ретинол поглощения от голо-RBP 41. Если ретинол искусственно выпустили или в свободной форме, чтобы начать с 45,46, рецептор RBP не нужен. Резко отличается от результатов, полученных свободной анализа диффузии ретинола по сравнению с анализы, основанные на правильно подготовленную голо-RBP показывают, что правильная подготовка RBP имеет решающее значение для его функционального анализа. RBP может быть очищен из сыворотки крови человека 41, но процедура является сложной и низкая урожайность. Альтернативным подходом является создание RBP в E. палочки. Потому E. палочки не имеют возможности правильно сложить млекопитающих секретируемых белков с более чем одной парой дисульфидных связей, как RBP, важно, чтобы сложите RBP и очистить правильно сложить белка. Неправильно упакованных белков не только ведут себя иначе, исправлены сложенном RBP в различные анализы,но и привести к агрегации белков при хранении. По той же причине, апо-RBP производится только из высококачественных голо-РСБ. Мы описываем здесь оптимизированный протокол для получения высокого качества RBP загружены на 100% с ретинолом через бактериальные выражения, рефолдинг, и ВЭЖХ очистки. ВЭЖХ очистки не только удаляет неправильно сложил ОДП, но и значительное бактериальное загрязнение, которое может вызвать серьезные артефакты, если RBP используются в анализах сигнала. Мы также описывают два чувствительных мониторинга в реальном времени методы для изучения ретинол транспорта STRA6. Оба метода зависит от высокого качества RBP. Из-за ограниченности пространства, классические методы радиоактивного ретиноидов основе и ВЭЖХ на основе витамина А поглощение анализы не были описаны здесь.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название Реагенты / Материал </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> гуанидингидрохлорида </td><td> EMD </td><td> 5010 </td><td></td></tr><tr><td> цистин </td><td> Сигма </td><td> C8755 </td><td></td></tr><tr><td> цистеин </td><td> Сигма </td><td> C7352 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Рыбак </td><td> BP118-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tris </td><td> Рыбак </td><td> 7786-1 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> EMD </td><td> 3860 </td><td></td></tr><tr><td> ретинол </td><td> Сигма </td><td> R7632 </td><td></td></tr><tr><td> карбенициллин </td><td> Рыбак </td><td> BP2648-5 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> EMD </td><td> 5810 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> EMD </td><td> 6508 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Рыбак </td><td> BP358-10 </td><td></td></tr><tr><td> Ni-NTA </td><td> Qiagen </td><td> 1018244 </td><td></td></tr><tr><td> имидазол </td><td> EMD </td><td> 5720 </td><td></td></tr><tr><td> гептан </td><td> EMD </td><td> HX0295-1 </td><td></td></tr><tr><td> Blocker казеина </td><td> Проколоть </td><td> 37528 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon Ультра 15 концентратора (MWCO10 K) </td><td> Millipore </td><td> UFC901024 </td><td></td></tr><tr><td> Microfluor-2 пластины </td><td> Рыбак </td><td> 14-245-177 </td><td></td></tr><tr><td> Гамильтон шприц Газонепроницаемый # 1710 </td><td> Рыбак </td><td> 14-824-655 </td><td></td></tr></tbody></table>

real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein

Витамин А необходим для зрения и роста / дифференциации практически всех органов человека. Плазменные ретинол-связывающего белка (РСБ) является принципом и конкретным носителем витамина А в крови. Здесь мы опишем технику оптимизированный для производства и очистки голо-RBP и два в реальном времени методы мониторинга для изучения транспорта витамина А на высокое сродство рецептора RBP STRA6. Первый метод позволяет производить большое количество высококачественного голо-RBP (100% загружены с ретинолом) витамина транспорта анализов. Высокое качество RBP имеет важное значение для функционального анализа, потому что неправильно свернутых RBP-релизы витамин А легко и бактериального загрязнения в подготовке RBP может привести к появлению артефактов. Мониторинг в реальном времени методы, как электрофизиологии внесли решающий вклад в исследования мембранного транспорта. RBP рецептор-опосредованного транспорта ретинола не были проанализированы в реальном времени до недавнего времени. Второй метод, описанный здесь, является причинамл-временной анализ STRA6 катализируемой ретинол освобождение или нагрузки. Третий способ в режиме реального времени анализ STRA6 катализируемой ретинол транспорта от голо-RBP к сотовым ретинол связывающий белок I (CRBP-I). Эти технологии обеспечивают высокую чувствительность и разрешение при выявлении витамина RBP рецептора механизм усвоения.

Мы приведем здесь представитель результатов голо-RBP производства и очистки с помощью ВЭЖХ (рис. 1), в режиме реального времени анализ STRA6 катализируемой ретинол освобождение от голо-RBP и ретинола загрузки в апо-ОДП (рис. 2) и в режиме реального времени анализ STRA6 катализир...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein at JoVE.com

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Здесь мы опишем технику оптимизированный для производства высококачественных витаминов A / RBP комплекс и два мониторинга в реальном времени методы для изучения витамина транспорта STRA6, RBP рецепторов.

В режиме реального времени Анализы транспорта ретинола на мембранный рецептор плазменных Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Измерение плазматической мембраны Белки Endocytic Цены на Реверсивные биотинилирование

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Количественное измерение GLUT4 транслокации к плазматической мембраны с помощью проточной цитометрии

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Biochemical Reconstitution of Steroid ReceptorÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â¢Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Биохимические Восстановление стероидных рецепторов • Hsp90 белковые комплексы и Реактивация связывания лигандов

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Отображение молекулярной диффузии в плазме мембраны Несколько-Target трассировки (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

Мониторинг в реальном времени лиганд-рецепторных взаимодействий с флуоресцентной резонансного переноса энергии

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Очистки белков-Free метод привязки Определение Affinity по Микромасштабные Термофорез

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Автономно Биолюминесцентный клетках млекопитающих для непрерывных и мониторинга в реальном времени цитотоксичности

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

Изображений с плазменным Мембрана Деформации С pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

В режиме реального времени измерения мембранного белка: рецептор взаимодействий с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Зеленый флуоресцентный белок на основе Expression Скрининг мембранных белков в<em&gt; Кишечная палочка</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...