Name: stereotactic injection of microrna-expressing lentiviruses to the mouse hippocampus ca1 region and assessment of the behavioral outcome
Uploaded: 2013-06-10T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome Video at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door de Edmond en Lily Safra Center for Brain Sciences (SB fellowship), The Legacy Heritage Biomedical Science Partnership Program van de Israel Science Foundation (Grant No 378/11, naar HS) en de Duitse Israëlische Stichting Wetenschappelijk Onderzoek en ontwikkeling (GIF) (Grant No 1093-32.2/2010, naar HS).

1. Lentivirus Voorbereiding <ol><li> Grow HEK-293FT cellen tot 90% confluentie. </li><li> Op de dag van transfectie verandering celmedium aan serum-vrij DMEM aangevuld met 1 mM glutamine en 50 mg / ml penicilline-streptomycine. </li><li> Co-transfecteren van de cellen met een pLKO.1-Puro vector en plasmiden coderend voor de delta R8.2 en VSV-G groepen en miRNA plaats, met 10 ui van 1 mg / ml polyethyleenimine als drager 9. </li><li> Verzamel verpakte lentiviruses bij 24 uur en 48 uur na transfectie, filter ...

<ol>
	<li>Siegel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+screen+implicates+microRNA-138-dependent+regulation+of+the+depalmitoylation+enzyme+APT1+in+dendritic+spine+morphogenesis.">A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis.</a> Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).</li><li>Jin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+genetic+interaction+between+the+fragile+X+mental+retardation+protein+and+the+microRNA+pathway.">Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway.</a> Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).</li><li>Simon, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+miR-1+regulates+a+MEF-2-dependent+retrograde+signal+at+neuromuscular+junctions.">The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions.</a> Cell. 133, 903-915 (2008).</li><li>Consiglio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+therapy+of+metachromatic+leukodystrophy+by+lentiviral+vectors:+correction+of+neuropathology+and+protection+against+learning+impairments+in+affected+mice.">In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice.</a> Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).</li><li>Jakobsson, J., Lundberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+for+use+in+the+central+nervous+system.">Lentiviral vectors for use in the central nervous system.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).</li><li>Berson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic-associated+loss+of+hnRNP-A/B+in+Alzheimer's+disease+impairs+cortical+splicing+and+cognitive+function+in+mice.">Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer's disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice.</a> EMBO Molecular Medicine. , (2012).</li><li>Haramati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+as+repressors+of+stress-induced+anxiety:+the+case+of+amygdalar+miR-34.">MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).</li><li>Shaltiel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+microRNA-132+mediates+stress-inducible+cognitive+deficits+through+its+acetylcholinesterase+target.">Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target.</a> Brain Structure &amp; Function. , 10-1007 (2012).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).</li><li>Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+HIV-+or+FIV-based+lentivector+expression+constructs+&amp;+transduction+of+VSV-G+pseudotyped+viral+particles.">Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs &amp; transduction of VSV-G pseudotyped viral particles.</a> J. Vis. Exp. (62), e3171 (2012).</li><li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morris+Water+Maze+Experiment.">Morris Water Maze Experiment.</a> J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).</li><li>Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morris+water+maze+test+for+learning+and+memory+deficits+in+Alzheimer's+disease+model+mice.">Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice.</a> J. Vis. Exp. (53), e2920 (2011).</li><li>Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+approach+for+intracerebroventricular+delivery.">Genetic approach for intracerebroventricular delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).</li></ol>

Stereotactische injectie van een lentivirus is een relatief snelle methode voor in vivo evaluatie voor zowel up-of down-regulatie van verschillende genen en miRNAs. Het belangrijkste alternatief is een genetisch gemanipuleerde muis wat een veel meer arbeidsintensief en tijdrovend techniek dan direct lentivirus injectie. Bovendien, de omhoog regulering, in lentivirus injectie plaats op een bepaald tijdstip in de volwassen muis en de mogelijkheid van lekkage omvat niet tijdens de ontwikkeling, zoals meestal het g...

De rol van bepaalde miRNA&#39;s in het zenuwstelsel functioneren is onlangs uitgedaagd door lentivirale injectie in verschillende studies. MiRNAs zijn gevonden van cruciaal belang voor het behoud en het opnieuw vormgeven synaps structuur 1, synaptogenese 2 en synaps verbouwing en onderhoud 3 te zijn. Deze studies suggereren sterk dat miRNAs betrokken zijn, via multileveled regulerende effecten in zowel de vormgeving en het behoud van de hoofduitgang van het zenuwstelsel, cognitieve functie. Stereotactische injectie van lentivirus deeltjes in specifieke regio&#39;s in de knaagdieren hersenen in staat stelt te zoeken naar veranderingen in de synaps morfologie en neuronale activiteit, en werd gebruikt voor het vaststellen van de functionele betekenis van overexpressie gebrachte transcripten 4,5. Directe infectie van neuronen bij welbepaalde hersengebieden met miRNA-expressie lentiviruses kunnen worden betrokken bij studies van veroudering, hersenaandoeningen en neurodegeneratie; Studies van miRNAs in het gebied van 6-8 gedragregulatie zijn dan veel minder gevorderd stadium en stereotactische injectie van miRNA-expressie lentivirus deeltjes gevolgd door gedragstesten kunnen nuttig zijn voor deze doeleinden. Een aanzienlijk meer bewerkelijke methode voor het induceren van over-of onder-expressie impliceert genetisch gemanipuleerde knock-in of knock-out muizen. Genetische systemen kan verder zorgen voor voorwaardelijke en temporele controle van expressie (bijv. Cre-Lox, Tet systemen), maar deze hebben nauwelijks ruimtelijke specificiteit van de injectieprocedure en er is bijna altijd een zekere mate van lekkage. Ook moet je de technische procedures niet operatie nodig en kan over laboratoria met een relatief goede reproduceerbaarheid worden gebruikt, maar ze zijn langzamer en vereisen veel meer mankracht en financiële middelen. Bovendien, de temporele controle van de over-of onder-expressie in muizen geïnjecteerd veel nauwkeuriger vergelijking met genetisch gemanipuleerde muizen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="748">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Rodent weigh scale</td>
			<td>Burtons (UK)</td>
			<td>115-455</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24">heating pad</td>
			<td>FIRstTechnology</td>
			<td>DCT-25</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">trimming machine</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51465</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">stereotact</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51730</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Scalpel and blades</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td>INS500348</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Harland syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7632-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">driller</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51449</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">digital pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>704507</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Water tank and platform</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>60135</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="682">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">ketamine </td>
			<td>Vetoquinol(Lure France)</td>
			<td>3055503</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">domitor</td>
			<td>Orion pharma</td>
			<td>107140-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Rimadyl</td>
			<td>Pfizer animal health</td>
			<td>24751</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="118">
			<td height="138" rowspan="2">moisture ointment - Synthomycine 5%</td>
			<td rowspan="2">Rekah Pharmaceutical</td>
			<td rowspan="2">195</td>
			<td rowspan="2"> </td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">histoacryl</td>
			<td>Braun</td>
			<td>112101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotactic injection of microrna-expressing lentiviruses to the mouse hippocampus ca1 region and assessment of the behavioral outcome

MicroRNAs (miRNAs) zijn kleine reglementaire enkelstrengs RNA-moleculen ongeveer 22 nucleotiden lang, dat kan elke doelgroep talrijke mRNA-transcripten en dim een ​​hele genexpressie traject door het induceren van vernietiging en / of het remmen van vertaling van deze doelstellingen. Verschillende miRNAs een belangrijke rol spelen bij het handhaven van neuronale structuur en functie en in hogere hersenfuncties, en methoden worden gezocht voor het manipuleren van hun niveaus voor het verkennen van deze functies. Hier presenteren we een directe in-vivo methode voor de behandeling van de cognitieve gevolgen van gedwongen miRNAs overtollige bij muizen door stereotactische injectie van miRNA-codering virusdeeltjes. In het bijzonder, het huidige protocol omvat injectie in de hippocampus CA1 regio, wat bijdraagt ​​aan zoogdieren geheugen consolidatie, leren, en stressrespons, en biedt een handige injectieplaats. De coördinaten worden gemeten volgens de muis bregma en virus perfusie digitaal gestuurd en zeer traag gehouden.Na injectie, wordt de operatie wond verzegeld en de dieren herstellen. Lentiviruses coderen geluiddempers van de overeenkomstige mRNA doelen dienen om de specifieke miRNA / target interactie verantwoordelijk zijn voor het waargenomen effect impliceren, met naïeve muizen, muizen geïnjecteerd met een zoutoplossing en muizen geïnjecteerd met &quot;lege&quot; lentivirus vectoren als controles. Een maand na de injectie worden de dieren onderzocht in het Morris Water Maze (MWM) voor het beoordelen van hun navigatie leren en geheugen capaciteiten. De MWM is een ronde tank gevuld met gekleurd water met een klein platform ondergedompeld 1 cm onder het wateroppervlak. Gestage visuele aanwijzingen rond de tank zorgen voor ruimtelijke navigatie (geluid en magnetische veld van de aarde kan ook de dieren te helpen navigeren). Videocamera controle maakt het meten van de route van zwemmen en de tijd te vinden en bedraagt ​​het platform. De muis wordt eerst geleerd dat het monteren van de verborgen platform biedt een ontsnapping aan de gedwongen zwemmen, het wordt dan getest voor het gebruik van deze ontsnapping en fenslotte, wordt het platform verwijderd en probetesten onderzoeken of de muis onthoudt de vorige locatie. Herhaalde tests een aantal dagen achtereen markeren verbeterde prestaties van de geteste muizen op kortere wachttijden te vinden en monteren van het platform, en als meer directe routes naar het platform of de locatie te bereiken. Bij no-show dergelijke verbetering vertegenwoordigt slechtzienden leren en geheugen en / of angst, die dan specifiek kan worden getest (bv. in de verhoogde plus maze). Deze aanpak maakt validatie van specifieke miRNAs en target transcripten in de bestudeerde cognitieve en / of stress-gerelateerde processen.

Injectie van 0,5 ul lentivirus in het CA1 gebied in de muis hippocampus, de stroomsnelheid die in de paragraaf protocol levert een geïnfecteerde gebied van ongeveer 1 mm in de rostrale-caudale as en ongeveer 0,5 mm in de mediale-laterale en anterieure -posterieure as (figuur 3). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/50170/50170fig1.jpg" /> Figuur 1. Bregma point en injectie-inrichting. (A) Afgebeeld is een sch...

Watch this Scientific Journal Video about Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome Video at JoVE.com

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome Video (Video) | JoVE

MicroRNA een belangrijke rol spelen in hersenstructuur en functie. Hier beschrijven we een methode om hippocampus miRNA dwingen over-expressie met behulp van stereotactische injectie van een aangelegde miRNA-expressie lentivirus. Deze benadering kan dienen als een relatief snelle manier om te beoordelen<em&gt; In vivo</em&gt; Effecten van over-expressie miRNA&#39;s in specifieke hersengebieden.

Stereotactische injectie van MicroRNA expressie Lentivirussen om de muis Hippocampus CA1 regio en Evaluatie van de Behavioral Outcome

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

Research

JoVE Journal

Behavior

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

Behavioral Phenotyping of Murine Disease Models with the Integrated Behavioral Station (INBEST)

Behavioral Phenotyping of Murine Disease Models with the Integrated Behavioral Station INBEST Video (Video) | JoVE

Behavioral Fenotypering van Muriene Disease Modellen met de Integrated Behavioral Station (INBEST)

Due to rapid advances in genetic engineering, small rodents have become the preferred subjects in many disciplines of biomedical research. In studies of ...

Behavioral Assessment of the Aging Mouse Vestibular System

Behavioral Assessment of the Aging Mouse Vestibular System Video (Video) | JoVE

Behavioral Assessment van de Aging Mouse evenwichtsorgaan

Age related decline in balance performance is associated with deteriorating muscle strength, motor coordination and vestibular function. While a number of ...

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience Video (Video) | JoVE

Uitgebreide analyse van de transcriptie van Brain Dynamics Monsters Na Behavioral Experience

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific ...

Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach

Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach Video (Video) | JoVE

Experimentele Evaluatie van de muis Gezelligheid behulp van een geautomatiseerd Beeldverwerking Approach

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the ...

Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors

Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors Video (Video) | JoVE

Het toepassen van stereotactische injectie techniek om genetische effecten op Animal Gedrag Studie

Stereotactic injection is a useful technique to deliver high titer lentiviruses to targeted brain areas in mice. Lentiviruses can either overexpress or ...

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning Video (Video) | JoVE

Nervus Vagus Stimulatie als een Tool om plasticiteit te induceren in Pathways Relevant voor Extinction Learning

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been ...

The Rodent Psychomotor Vigilance Test (rPVT): A Method for Assessing Neurobehavioral Performance in Rats and Mice

The Rodent Psychomotor Vigilance Test RPVT: A Method for Assessing Neurobehavioral Performance in Rats and Mice Video (Video) | JoVE

De knaagdieren Psychomotorische Waakzaamheid Test (rPVT): Een methode voor het beoordelen van Neurobehavioral bij ratten en muizen

The human Psychomotor Vigilance Test (PVT) is a widely used procedure for measuring changes in fatigue and sustained attention. The present article ...

Behavioral Assessment of Hearing in 2 to 4 Year-old Children: A Two-interval, Observer-based Procedure Using Conditioned Play-based Responses

Behavioral Assessment of Hearing in 2 to 4 Year-old Children: A Two-interval, Observer-based Procedure Using Conditioned Play-based Responses Video (Video) | JoVE

Behavioral Assessment van Hoorzitting in 2-4 jaar oude kinderen: een twee-interval, Observer-gebaseerde procedure Met behulp van geconditioneerde-Play gebaseerd Responses

Collecting reliable behavioral data from toddlers and preschoolers is challenging. As a result, there are significant gaps in our understanding of human ...

Measuring Active and Passive Tameness Separately in Mice

Measuring Active and Passive Tameness Separately in Mice Video (Video) | JoVE

Meten van actieve en passieve Tameness afzonderlijk in muizen

Domesticated animals such as dogs and laboratory mice show a high level of tameness, which is important for humans to handle them easily. Tameness has two ...

The Unpredictable Chronic Mild Stress Protocol for Inducing Anhedonia in Mice

The Unpredictable Chronic Mild Stress Protocol for Inducing Anhedonia in Mice Video (Video) | JoVE

Het Protocol van de onvoorspelbare chronische milde Stress voor inducerende Anhedonie in muizen

Depression is a highly prevalent and debilitating condition, only partially addressed by current pharmacotherapies. The lack of response to treatment by ...