Name: stereotactic injection of microrna-expressing lentiviruses to the mouse hippocampus ca1 region and assessment of the behavioral outcome
Uploaded: 2013-06-10T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome Video at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מרכז אדמונד ולילי ספרא למדעי המוח (SB מלגה), התכנית המורשית ביו רפואית מדע השותפות של הקרן הלאומית למדע (מענק מס &#39;378/11, ל&quot;מ) וקרן גרמנית למדע מחקר ופיתוח (GIF) (גרנט 1093-32.2/2010 מס, לHS).

1. הכנת lentivirus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאי HEK-293FT למפגש 90%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של מדיום סלולארי שינוי transfection לסרום ללא DMEM בתוספת גלוטמין 1 מ&quot;מ ו -50 פניצילין, סטרפטומיצין מ&quot;ג / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיתוף transfect התא?...

<ol>
	<li>Siegel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+screen+implicates+microRNA-138-dependent+regulation+of+the+depalmitoylation+enzyme+APT1+in+dendritic+spine+morphogenesis.">A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis.</a> Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).</li><li>Jin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+genetic+interaction+between+the+fragile+X+mental+retardation+protein+and+the+microRNA+pathway.">Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway.</a> Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).</li><li>Simon, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+miR-1+regulates+a+MEF-2-dependent+retrograde+signal+at+neuromuscular+junctions.">The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions.</a> Cell. 133, 903-915 (2008).</li><li>Consiglio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+therapy+of+metachromatic+leukodystrophy+by+lentiviral+vectors:+correction+of+neuropathology+and+protection+against+learning+impairments+in+affected+mice.">In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice.</a> Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).</li><li>Jakobsson, J., Lundberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+for+use+in+the+central+nervous+system.">Lentiviral vectors for use in the central nervous system.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).</li><li>Berson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic-associated+loss+of+hnRNP-A/B+in+Alzheimer's+disease+impairs+cortical+splicing+and+cognitive+function+in+mice.">Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer's disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice.</a> EMBO Molecular Medicine. , (2012).</li><li>Haramati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+as+repressors+of+stress-induced+anxiety:+the+case+of+amygdalar+miR-34.">MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).</li><li>Shaltiel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+microRNA-132+mediates+stress-inducible+cognitive+deficits+through+its+acetylcholinesterase+target.">Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target.</a> Brain Structure &amp; Function. , 10-1007 (2012).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).</li><li>Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+HIV-+or+FIV-based+lentivector+expression+constructs+&amp;+transduction+of+VSV-G+pseudotyped+viral+particles.">Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs &amp; transduction of VSV-G pseudotyped viral particles.</a> J. Vis. Exp. (62), e3171 (2012).</li><li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morris+Water+Maze+Experiment.">Morris Water Maze Experiment.</a> J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).</li><li>Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morris+water+maze+test+for+learning+and+memory+deficits+in+Alzheimer's+disease+model+mice.">Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice.</a> J. Vis. Exp. (53), e2920 (2011).</li><li>Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+approach+for+intracerebroventricular+delivery.">Genetic approach for intracerebroventricular delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).</li></ol>

הזרקת Stereotactic של lentivirus היא שיטה מהירה יחסית להערכה בvivo עבור שניהם למעלה או למטה רגולציה של גנים וmiRNAs שונים. החלופה העיקרית היא עכבר מהונדס גנטי אשר הוא טכניקה רב הרבה יותר מפרכת ושעה לאחר מכן זריקת lentivirus ישירה. בנוסף, הרגולציה למעלה, בהזרקת lentivirus, מתרחשת בזמן מסוי?...

התפקיד של miRNAs מסוימת בתפקוד מערכת עצבים באחרונה לערער על ידי הזרקת lentiviral במספר מחקרים. MiRNAs כבר מצא להיות חיוני לשמירה ועיצוב מחדש מבנה סינפסה 1, 2 synaptogenesis ושיפוץ סינפסה ותחזוקה 3. מחקרים אלה ממליצים כי miRNAs עוסקות, דרך השפעות הרגולטוריות ריבוד בשניהם בעיצוב למעלה ובשמירה על התפוקה העיקרית של מערכת העצבים, תפקוד הקוגניטיבי. הזרקה של חלקיקי Stereotactic lentivirus לאזורים ספציפיים במוח המכרסם מאפשרת מחפשת שינויים במורפולוגיה סינפסה ופעילות עצבית, ושימש להקמת המשמעות התפקודית של תמלילי ביטוי יתר 4,5. זיהום ישיר של תאי עצב באזורי המוח מוגדרים היטב עם lentiviruses מירנה-להביע עשויה להיות מעורב במחקרים של הזדקנות, הפרעות במוח וניוון מוחיים, מחקרים של מירנהים בתחום של רגולציה התנהגותית 6-8 נמצא במצב הרבה פחות מתקדם, והזרקת stereotactic של מירנה-להביע חלקיקי lentivirus ואחרי בדיקות התנהגותיות עשוי להיות שימושי למטרות האמורות. שיטה הרבה יותר מייגע לגרימה מעל או מתחת, ביטוי כרוך בהנדסה גנטית עכברים בנוקאאוט דפיקה באו. מערכות גנטיות נוספות יכולות לאפשר לבקרה מותנית ובזמן על ביטוי (למשל Cre-קס, מערכות ט), אך אלה כמעט לא להציע סגוליות המרחבי של הליך ההזרקה וכמעט תמיד יש כמות מסוימת של דליפות. כמו כן, את הנהלים ההנדסיים אינם דורשים ניתוח, וניתן להשתמש בכל מעבדות עם שחזור טוב יחסית, עם זאת, שהם איטיים יותר ודורשים הרבה יותר כוח אדם ובמשאבים כספיים. בנוסף, השליטה הזמנית של מעל או מתחת הביטוי בעכברים שהוזרקו הוא הרבה יותר מדויק בהשוואה לעכברים מהונדסים גנטי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="748">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Rodent weigh scale</td>
			<td>Burtons (UK)</td>
			<td>115-455</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24">heating pad</td>
			<td>FIRstTechnology</td>
			<td>DCT-25</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">trimming machine</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51465</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">stereotact</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51730</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Scalpel and blades</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td>INS500348</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Harland syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7632-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">driller</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51449</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">digital pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>704507</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Water tank and platform</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>60135</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="682">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">ketamine </td>
			<td>Vetoquinol(Lure France)</td>
			<td>3055503</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">domitor</td>
			<td>Orion pharma</td>
			<td>107140-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Rimadyl</td>
			<td>Pfizer animal health</td>
			<td>24751</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="118">
			<td height="138" rowspan="2">moisture ointment - Synthomycine 5%</td>
			<td rowspan="2">Rekah Pharmaceutical</td>
			<td rowspan="2">195</td>
			<td rowspan="2"> </td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">histoacryl</td>
			<td>Braun</td>
			<td>112101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotactic injection of microrna-expressing lentiviruses to the mouse hippocampus ca1 region and assessment of the behavioral outcome

מיקרו RNA (miRNAs) הם מולקולות רגולטוריות קטנות חד גדילי RNA כ -22 נוקלאוטידים ארוכים שעשוי כל יעד תעתיקי mRNA רבים ומסלול כולו עמום ביטוי גנים על ידי הרס ו / או תרגום עיכוב של יעדים אלה ישכנעו. כמה miRNAs לשחק תפקיד מפתח בשמירה על מבנה ותפקוד עצביים ובתפקודי מוח ברמה גבוהה יותר, והם חיפשו שיטות לרמותיהם מניפולציה בשביל לחקור את הפונקציות האלה. כאן, אנו מציגים שיטה ישירה בvivo לבחינת ההשלכות הקוגניטיביות של miRNAs נאכפה עודפת בעכברים על ידי הזרקה של חלקיקי נגיף stereotactic מירנה קידוד. באופן ספציפי, בפרוטוקול הנוכחי כרוך בהזרקה לאזור CA1 בהיפוקמפוס, התורמת לגיבוש יונקים זיכרון, למידה, ותגובות לחץ, ומציע הזריקה נוחה. את הקואורדינטות נמדדות לפי גבחת העכבר וזלוף הווירוס נמצא בשליטה דיגיטלית ושמר איטיים מאוד.לאחר הזרקה, פצע הניתוח הוא חתום ואת בעלי החיים להתאושש. Lentiviruses קידוד משתיקי קול של מטרות mRNA המתאימות לשמש כדי לסבך את מירנה / יעד האינטראקציה הספציפית אחראית לאפקט הנצפה, עם עכברים נאיביים, עכברים שהוזרקו עם מי מלח ועכברים שהוזרקו עם וקטורי lentivirus &quot;ריקים&quot; כקבוצת ביקורת. חודש אחד לאחר ההזרקה, החיות נבחנות במבוך המים של מוריס (MWM) להערכת למידת הניווט שלהם ויכולות זיכרון. MWM הוא המכל עגול מלאים במים צבעוניים עם פלטפורמה קטנה שקועה 1 ס&quot;מ מתחת לפני המים. רמזים חזותיים יציבים סביב הטנק לאפשר ניווט המרחבי (קול והשדה המגנטי של כדור הארץ עשוי גם לסייע לבעלי החיים בניווט). ניטור מצלמת וידאו מאפשר מדידת מסלול השחייה ואת הזמן כדי למצוא ויסתכם בפלטפורמה. העכבר ראשון שלמד את ההרכבה הפלטפורמה הנסתרת מציעה מפלט מהחייה הכפויה, אלא לאחר מכן הוא נבדק על שימוש בבריחה וF זהinally, הפלטפורמה מוסרת ובדיקות בדיקה לבחון אם העכבר זוכר את מיקומו הקודם. בדיקות חוזרות ונשנות על פני כמה ימים רצופים להדגיש ביצועים משופרים של עכברים נבדקו בlatencies קצר יותר כדי למצוא ולהתקין את הפלטפורמה, ומסלולים כיותר ישירים כדי להגיע לפלטפורמה או מיקומו. כישלון להראות שיפור כזה מייצג לקוי למידה וזיכרון ו / או חרדה, אשר לאחר מכן ניתן לבחון באופן ספציפי (לדוגמה: במבוך בתוספת המוגבה). גישה זו מאפשרת אימות של miRNAs ספציפית ותמלילי היעד בהקוגניטיבית ו / או תהליכים הקשורים ללחץ למד.

הזרקה של 0.5 lentivirus μl לאזור CA1 בהיפוקמפוס העכבר, עם קצב הזרימה מצויינים בסעיף הפרוטוקול מניבה תחום נגוע של כ 1 מ&quot;מ בציר מקורי, הזנב, ועל 0.5 מ&quot;מ וברוחב המדיאלי-הקדמי צירים אחוריים-(איור 3). <img alt="איור 1" src...

Watch this Scientific Journal Video about Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome Video at JoVE.com

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome Video (Video) | JoVE

יש מיקרו RNA תפקידים משמעותיים במבנה המוח ותפקודו. כאן אנו מתארים שיטה לאכיפת מירנה היפוקמפוס יתר ביטוי באמצעות הזרקת stereotactic של lentivirus מירנה מביע מהונדס. גישה זו יכולה לשמש כדרך מהירה יחסית על מנת להעריך את<em&gt; In vivo</em&gt; השפעות של miRNAs ביטוי יתר של אזורים ספציפיים במוח.

Lentiviruses הזרקת Stereotactic של microRNA-לבטא באזור CA1 היפוקמפוס העכבר והערכה של תוצאות ההתנהגות

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

Research

JoVE Journal

Behavior

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

Behavioral Phenotyping of Murine Disease Models with the Integrated Behavioral Station (INBEST)

Behavioral Phenotyping of Murine Disease Models with the Integrated Behavioral Station INBEST Video (Video) | JoVE

ההתנהגות phenotyping של מודלי Murine מחלות עם ההתנהגות המשולבת התחנה (INBEST)

Due to rapid advances in genetic engineering, small rodents have become the preferred subjects in many disciplines of biomedical research. In studies of ...

Behavioral Assessment of the Aging Mouse Vestibular System

Behavioral Assessment of the Aging Mouse Vestibular System Video (Video) | JoVE

התנהגות הערכה של מערכת שיווי המשקל עכבר ההזדקנות

Age related decline in balance performance is associated with deteriorating muscle strength, motor coordination and vestibular function. While a number of ...

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience Video (Video) | JoVE

ניתוח מקיף של תמלול Dynamics מדוגמאות המוח בעקבות ניסיון התנהגות

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific ...

Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach

Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach Video (Video) | JoVE

ההערכה הניסויית של עכבר חברותי בגישת עיבוד תמונה אוטומטית

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the ...

Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors

Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors Video (Video) | JoVE

יישום טכניקת הזרקת stereotactic לחקר השפעות גנטיות על התנהגות בעלי החיים

Stereotactic injection is a useful technique to deliver high titer lentiviruses to targeted brain areas in mice. Lentiviruses can either overexpress or ...

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning Video (Video) | JoVE

הקוצב וגאלי ככלי כדי לגרום פלסטיות במסלולים רלוונטיים ללמידה הכחדה

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been ...

The Rodent Psychomotor Vigilance Test (rPVT): A Method for Assessing Neurobehavioral Performance in Rats and Mice

The Rodent Psychomotor Vigilance Test RPVT: A Method for Assessing Neurobehavioral Performance in Rats and Mice Video (Video) | JoVE

מבחן הערנות Psychomotor המכרסם (rPVT): שיטה להערכת ביצועי נוירו-התנהגותיות אצל חולדות ועכברים

The human Psychomotor Vigilance Test (PVT) is a widely used procedure for measuring changes in fatigue and sustained attention. The present article ...

Behavioral Assessment of Hearing in 2 to 4 Year-old Children: A Two-interval, Observer-based Procedure Using Conditioned Play-based Responses

Behavioral Assessment of Hearing in 2 to 4 Year-old Children: A Two-interval, Observer-based Procedure Using Conditioned Play-based Responses Video (Video) | JoVE

ערכה התנהגותית של שמיעה ב 2 עד 4 ילדים בת: נוהל דו מרווח, אובזרוור מבוסס שימוש תגובות Play מבוסס אלפו

Collecting reliable behavioral data from toddlers and preschoolers is challenging. As a result, there are significant gaps in our understanding of human ...

Measuring Active and Passive Tameness Separately in Mice

Measuring Active and Passive Tameness Separately in Mice Video (Video) | JoVE

מדידת Tameness פעילים וסבילים בנפרד בעכברים

Domesticated animals such as dogs and laboratory mice show a high level of tameness, which is important for humans to handle them easily. Tameness has two ...

The Unpredictable Chronic Mild Stress Protocol for Inducing Anhedonia in Mice

The Unpredictable Chronic Mild Stress Protocol for Inducing Anhedonia in Mice Video (Video) | JoVE

פרוטוקול לא צפוי מתח כרוני מתון להשראת אנהדוניה בעכברים

Depression is a highly prevalent and debilitating condition, only partially addressed by current pharmacotherapies. The lack of response to treatment by ...