Name: stereotactic injection of microrna-expressing lentiviruses to the mouse hippocampus ca1 region and assessment of the behavioral outcome
Uploaded: 2013-06-10T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome at JoVE.com

Это исследование было поддержано Эдмонда и Лили Сафра Центр Brain Sciences (SB общение), наследие Наследие биомедицинских наук Программы партнерства Израиля научного фонда (грант № 378/11, с ГС) и немецкого израильского фонда научно Исследования и разработки (GIF) (грант № 1093-32.2/2010, чтобы HS).

1. Подготовка Лентивирус <ol><li> Grow НЕК-клетки 293FT до 90% слияния. </li><li> В день трансфекции изменение клеточной среде в бессывороточной среде DMEM с добавлением 1 мМ глутамина и 50 мг / мл пенициллин-стрептомицина. </li><li> Со-трансфекции клеток с pLKO.1-Puro вектор и плазмидами, кодирующими дельта R8.2 и VS...

<ol>
	<li>Siegel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+screen+implicates+microRNA-138-dependent+regulation+of+the+depalmitoylation+enzyme+APT1+in+dendritic+spine+morphogenesis.">A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis.</a> Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).</li><li>Jin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+genetic+interaction+between+the+fragile+X+mental+retardation+protein+and+the+microRNA+pathway.">Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway.</a> Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).</li><li>Simon, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+miR-1+regulates+a+MEF-2-dependent+retrograde+signal+at+neuromuscular+junctions.">The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions.</a> Cell. 133, 903-915 (2008).</li><li>Consiglio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+therapy+of+metachromatic+leukodystrophy+by+lentiviral+vectors:+correction+of+neuropathology+and+protection+against+learning+impairments+in+affected+mice.">In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice.</a> Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).</li><li>Jakobsson, J., Lundberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+for+use+in+the+central+nervous+system.">Lentiviral vectors for use in the central nervous system.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).</li><li>Berson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic-associated+loss+of+hnRNP-A/B+in+Alzheimer's+disease+impairs+cortical+splicing+and+cognitive+function+in+mice.">Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer's disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice.</a> EMBO Molecular Medicine. , (2012).</li><li>Haramati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+as+repressors+of+stress-induced+anxiety:+the+case+of+amygdalar+miR-34.">MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).</li><li>Shaltiel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+microRNA-132+mediates+stress-inducible+cognitive+deficits+through+its+acetylcholinesterase+target.">Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target.</a> Brain Structure &amp; Function. , 10-1007 (2012).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).</li><li>Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+HIV-+or+FIV-based+lentivector+expression+constructs+&amp;+transduction+of+VSV-G+pseudotyped+viral+particles.">Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs &amp; transduction of VSV-G pseudotyped viral particles.</a> J. Vis. Exp. (62), e3171 (2012).</li><li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morris+Water+Maze+Experiment.">Morris Water Maze Experiment.</a> J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).</li><li>Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morris+water+maze+test+for+learning+and+memory+deficits+in+Alzheimer's+disease+model+mice.">Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice.</a> J. Vis. Exp. (53), e2920 (2011).</li><li>Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+approach+for+intracerebroventricular+delivery.">Genetic approach for intracerebroventricular delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).</li></ol>

Стереотаксической инъекции лентивирус является относительно быстрый метод для прижизненного оценивать как вверх или вниз-регулирование различных генов и микроРНК. Основной альтернативой является генетически модифицированные мыши, который является намного более длительными и...

Роль микроРНК в частности функционирования нервной системы недавно было оспорено лентивирусный инъекций в нескольких исследованиях. MiRNAs было установлено, что важно для поддержания и повторное формирование синапсов структуры 1, 2 синаптогенез и реконструкции синапсов и техническое обслуживание 3. Эти исследования убедительно показывают, что микроРНК занимаются, через многоуровневую регуляторных эффектов как в формировании и поддержании в основном выходе нервной системы, когнитивные функции. Стереотаксической инъекции лентивирус частиц в конкретных регионах в мозге грызунов позволяет поисках изменений в морфологии и синапсов нейронной активности, и был использован для создания функционального значения сверхэкспрессированные стенограммы 4,5. Прямая инфекции нейронов, находящихся в четко определенных областях мозга с микроРНК-экспрессирующих лентивирусы могут быть причастны исследования старения, заболеваний мозга и нейродегенеративные; исследований микроРНКы в области поведенческой регуляции 6-8 находятся на гораздо менее развитые государства, и стереотаксической инъекции микроРНК-экспрессирующих лентивирус частиц последующим поведенческие тесты могут использоваться для таких целей. Значительно более трудоемкий способ индукции избыточного или недостаточного-выражение содержит генетически модифицированные нок-ин или нокаут мышей. Генетические системы может дополнительно позволить условный и временной контроль экспрессии (например Cre-Lox, Tet системы), но они вряд ли предлагать пространственной специфичности процедуры инъекции и почти всегда имеется определенное количество неплотности. Кроме того, инженерные процедуры не требуют хирургического вмешательства и может использоваться во всех лабораторий с относительно хорошей воспроизводимости, но они медленнее и требуют гораздо больше трудовых и финансовых ресурсов. Кроме того, временной контроль избыточного или недостаточного-выражение в вводили мышам является гораздо более точным по сравнению с генетически модифицированных мышей.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="748">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Rodent weigh scale</td>
			<td>Burtons (UK)</td>
			<td>115-455</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24">heating pad</td>
			<td>FIRstTechnology</td>
			<td>DCT-25</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">trimming machine</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51465</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">stereotact</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51730</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Scalpel and blades</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td>INS500348</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Harland syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7632-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">driller</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51449</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">digital pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>704507</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Water tank and platform</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>60135</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="682">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">ketamine </td>
			<td>Vetoquinol(Lure France)</td>
			<td>3055503</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">domitor</td>
			<td>Orion pharma</td>
			<td>107140-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Rimadyl</td>
			<td>Pfizer animal health</td>
			<td>24751</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="118">
			<td height="138" rowspan="2">moisture ointment - Synthomycine 5%</td>
			<td rowspan="2">Rekah Pharmaceutical</td>
			<td rowspan="2">195</td>
			<td rowspan="2"> </td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">histoacryl</td>
			<td>Braun</td>
			<td>112101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotactic injection of microrna-expressing lentiviruses to the mouse hippocampus ca1 region and assessment of the behavioral outcome

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an entire gene expression pathway by inducing destruction and/or inhibiting translation of these targets. Several miRNAs play key roles in maintaining neuronal structure and function and in higher-level brain functions, and methods are sought for manipulating their levels for exploring these functions. Here, we present a direct in vivo method for examining the cognitive consequences of enforced miRNAs excess in mice by stereotactic injection of miRNA-encoding virus particles. Specifically, the current protocol involves injection into the hippocampal CA1 region, which contributes to mammalian memory consolidation, learning, and stress responses, and offers a convenient injection site. The coordinates are measured according to the mouse bregma and virus perfusion is digitally controlled and kept very slow. After injection, the surgery wound is sealed and the animals recover. Lentiviruses encoding silencers of the corresponding mRNA targets serve to implicate the specific miRNA/target interaction responsible for the observed effect, with na&iuml;ve mice, mice injected with saline and mice injected with "empty" lentivirus vectors as controls. One month post-injection, the animals are examined in the Morris Water Maze (MWM) for assessing their navigation learning and memory abilities. The MWM is a round tank filled with colored water with a small platform submerged 1 cm below the water surface. Steady visual cues around the tank allow for spatial navigation (sound and the earth's magnetic field may also assist the animals in navigating). Video camera monitoring enables measuring the route of swim and the time to find and amount the platform. The mouse is first taught that mounting the hidden platform offers an escape from the enforced swimming; it is then tested for using this escape and finally, the platform is removed and probe tests examine if the mouse remembers its previous location. Repeated tests over several consecutive days highlight improved performance of tested mice at shorter latencies to find and mount the platform, and as more direct routes to reach the platform or its location. Failure to show such improvement represents impaired learning and memory and/or anxiety, which may then be tested specifically (e.g. in the elevated plus maze). This approach enables validation of specific miRNAs and target transcripts in the studied cognitive and/or stress-related processes.

Инъекция 0,5 мкл лентивирусов в области СА1 в гиппокампе мышей, с расходом указано в протоколе раздел дает инфицированные области около 1 мм в ростральной-хвостовой оси и около 0,5 мм в медиальных-боковой и передней -задней оси (рис. 3). <img alt="Рисун...

Watch this Scientific Journal Video about Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome at JoVE.com

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome (Video) | JoVE

MicroRNAs играть значительную роль в структуре и функции мозга. Здесь мы опишем метод для обеспечения гиппокампа микроРНК сверхэкспрессию использованием стереотаксической инъекции инженерных микроРНК-экспрессирующих лентивирус. Этот подход может служить относительно быстрым способом оценки<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Эффекты сверхэкспрессированные микроРНК в определенных областях мозга.

Стереотаксической инъекции микроРНК-экспрессирующих Lentiviruses в области CA1 гиппокампа мыши и оценка поведенческих результатов

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

Research

JoVE Journal

Behavior

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

Behavioral Phenotyping of Murine Disease Models with the Integrated Behavioral Station (INBEST)

Behavioral Phenotyping of Murine Disease Models with the Integrated Behavioral Station INBEST (Video) | JoVE

Поведенческая Фенотипирование мышиный Disease Models с интегрированной поведенческой станции (INBEST)

Due to rapid advances in genetic engineering, small rodents have become the preferred subjects in many disciplines of biomedical research. In studies of ...

Behavioral Assessment of the Aging Mouse Vestibular System

Behavioral Assessment of the Aging Mouse Vestibular System (Video) | JoVE

Поведенческая оценка старения Mouse вестибулярной системы

Age related decline in balance performance is associated with deteriorating muscle strength, motor coordination and vestibular function. While a number of ...

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience (Video) | JoVE

Комплексный анализ транскрипции Dynamics от мозга образцов После поведенческой Опыт

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific ...

Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach

Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach (Video) | JoVE

Экспериментальная оценка мыши Общительность с помощью автоматизированной обработки изображений подход

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the ...

Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors

Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors (Video) | JoVE

Применяя Стереотаксическая техника инъекций по изучению генетических эффектов на животных Поведения

Stereotactic injection is a useful technique to deliver high titer lentiviruses to targeted brain areas in mice. Lentiviruses can either overexpress or ...

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning (Video) | JoVE

Стимуляция блуждающего нерва как инструмент, чтобы побудить пластичность Подготовка актуальным для вымирания обучения

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been ...

The Rodent Psychomotor Vigilance Test (rPVT): A Method for Assessing Neurobehavioral Performance in Rats and Mice

The Rodent Psychomotor Vigilance Test rPVT: A Method for Assessing Neurobehavioral Performance in Rats and Mice (Video) | JoVE

Грызун психомоторного Бдительность Test (rPVT): Метод оценки психофизиологические качества у крыс и мышей

The human Psychomotor Vigilance Test (PVT) is a widely used procedure for measuring changes in fatigue and sustained attention. The present article ...

Behavioral Assessment of Hearing in 2 to 4 Year-old Children: A Two-interval, Observer-based Procedure Using Conditioned Play-based Responses

Behavioral Assessment of Hearing in 2 to 4 Year-old Children: A Two-interval, Observer-based Procedure Using Conditioned Play-based Responses (Video) | JoVE

Поведенческая оценка слуха в 2 до 4-летних детей: артикль Два интервала, по наблюдению на основе Процедура Использование кондиционированной Play на основе ответов

Collecting reliable behavioral data from toddlers and preschoolers is challenging. As a result, there are significant gaps in our understanding of human ...

Basic Methods for the Study of Reproductive Ecology of Fish in Aquaria

Basic Methods for the Study of Reproductive Ecology of Fish in Aquaria (Video) | JoVE

Основные методы изучения репродуктивной экологии рыб в аквариуме

Captive-rearing observations are valuable for revealing aspects of fish behavior and ecology when continuous field investigations are impossible. Here, a ...

Measuring Active and Passive Tameness Separately in Mice

Measuring Active and Passive Tameness Separately in Mice (Video) | JoVE

Измерение активной и пассивной Tameness отдельно в мышей

Domesticated animals such as dogs and laboratory mice show a high level of tameness, which is important for humans to handle them easily. Tameness has two ...