Name: stereotactic injection of microrna-expressing lentiviruses to the mouse hippocampus ca1 region and assessment of the behavioral outcome
Uploaded: 2013-06-10T12:00:00
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Este estudio ha sido financiado por el Centro de Edmond Safra y Lily para las Ciencias del Cerebro (SB comunión), The Heritage Biomédica Programa de Asociación de Ciencia legado de la Israel Science Foundation (Grant N º 378/11, a HS) y la Fundación Alemana para la Ciencia de Israel Investigación y Desarrollo (GIF) (Grant No. 1093-32.2/2010, a HS).

1. Preparación Lentivirus <ol><li> Se cultivan las células HEK-293FT a 90% de confluencia. </li><li> En el día de la transfección medio celular cambio de DMEM libre de suero suplementado con 1 mM de glutamina y 50 mg / ml de penicilina-estreptomicina. </li><li> Co-transfectar las células con un vector pLKO.1-Puro y con plásmidos que codifican para la delta R8.2 y VSV-G restos y los genes miARN de interés, utilizando 10 l de 1 mg / ml de polietilenimina como un portador 9. </li><li> Recoger lentivirus...

<ol>
	<li>Siegel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+screen+implicates+microRNA-138-dependent+regulation+of+the+depalmitoylation+enzyme+APT1+in+dendritic+spine+morphogenesis.">A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis.</a> Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).</li><li>Jin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+genetic+interaction+between+the+fragile+X+mental+retardation+protein+and+the+microRNA+pathway.">Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway.</a> Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).</li><li>Simon, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+miR-1+regulates+a+MEF-2-dependent+retrograde+signal+at+neuromuscular+junctions.">The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions.</a> Cell. 133, 903-915 (2008).</li><li>Consiglio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+therapy+of+metachromatic+leukodystrophy+by+lentiviral+vectors:+correction+of+neuropathology+and+protection+against+learning+impairments+in+affected+mice.">In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice.</a> Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).</li><li>Jakobsson, J., Lundberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+for+use+in+the+central+nervous+system.">Lentiviral vectors for use in the central nervous system.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).</li><li>Berson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic-associated+loss+of+hnRNP-A/B+in+Alzheimer's+disease+impairs+cortical+splicing+and+cognitive+function+in+mice.">Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer's disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice.</a> EMBO Molecular Medicine. , (2012).</li><li>Haramati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+as+repressors+of+stress-induced+anxiety:+the+case+of+amygdalar+miR-34.">MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).</li><li>Shaltiel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+microRNA-132+mediates+stress-inducible+cognitive+deficits+through+its+acetylcholinesterase+target.">Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target.</a> Brain Structure &amp; Function. , 10-1007 (2012).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).</li><li>Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+HIV-+or+FIV-based+lentivector+expression+constructs+&amp;+transduction+of+VSV-G+pseudotyped+viral+particles.">Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs &amp; transduction of VSV-G pseudotyped viral particles.</a> J. Vis. Exp. (62), e3171 (2012).</li><li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morris+Water+Maze+Experiment.">Morris Water Maze Experiment.</a> J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).</li><li>Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morris+water+maze+test+for+learning+and+memory+deficits+in+Alzheimer's+disease+model+mice.">Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice.</a> J. Vis. Exp. (53), e2920 (2011).</li><li>Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+approach+for+intracerebroventricular+delivery.">Genetic approach for intracerebroventricular delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).</li></ol>

Inyección estereotáctica de un lentivirus es relativamente un método rápido para la evaluación in vivo, tanto para la altura o baja regulación de genes diferentes y miRNAs. La principal alternativa es un ratón genéticamente modificado que es una técnica consume mucho más laborioso y a continuación, inyección directa lentivirus. Además, la regulación hacia arriba, en la inyección de lentivirus, se produce en un momento específico en el ratón adulto y no incluye la posibilidad de permeab...

El papel de los miRNAs específicos en el funcionamiento del sistema nervioso ha sido recientemente cuestionado por inyección lentiviral en varios estudios. MiRNAs se han encontrado para ser crucial para el mantenimiento y la re-formación de la estructura sinapsis 1, 2 sinaptogénesis y la remodelación de sinapsis y mantenimiento 3. Estos estudios sugieren fuertemente que los miRNAs están comprometidos, a través de efectos reguladores múltiples niveles, tanto en la conformación y en el mantenimiento de la salida principal del sistema nervioso, la función cognitiva. Inyección estereotáctica de las partículas de lentivirus en regiones específicas en el cerebro de roedores permite la búsqueda de alteraciones en la morfología de la sinapsis y la actividad neuronal, y se utilizó para establecer el significado funcional de las transcripciones sobreexpresados ​​4,5. La infección directa de las neuronas en áreas del cerebro bien definidos con miARN-expresión de los lentivirus pueden estar implicados en estudios de envejecimiento, trastornos cerebrales y la neurodegeneración; Estudios de miRNAs en el ámbito de la regulación del comportamiento 6-8 están en un estado mucho menos avanzada, y la inyección estereotáctica de los genes miARN-expresando partículas de lentivirus seguido por pruebas de comportamiento puede ser útil para tales fines. Un método mucho más laborioso para inducir la sobre o sub-expresión implica ingeniería genética knock-in o ratones knockout. Sistemas genéticos pueden permitir para un control condicional y temporal en la expresión (por ejemplo, Cre-Lox, los sistemas Tet), pero éstos apenas ofrecer la especificidad espacial del procedimiento de inyección y casi siempre hay una cierta cantidad de falta de estanqueidad. Además, los procedimientos de ingeniería no requieren cirugía y se pueden utilizar a través de laboratorios con relativamente buena reproducibilidad, sin embargo, son más lentos y requieren mucha más mano de obra y de recursos financieros. Además, el control temporal de la sobre o sub-expresión en ratones inyectados es mucho más preciso en comparación con ratones modificados genéticamente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="748">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Rodent weigh scale</td>
			<td>Burtons (UK)</td>
			<td>115-455</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24">heating pad</td>
			<td>FIRstTechnology</td>
			<td>DCT-25</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">trimming machine</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51465</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">stereotact</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51730</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Scalpel and blades</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td>INS500348</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Harland syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7632-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">driller</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51449</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">digital pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>704507</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Water tank and platform</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>60135</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="682">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">ketamine </td>
			<td>Vetoquinol(Lure France)</td>
			<td>3055503</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">domitor</td>
			<td>Orion pharma</td>
			<td>107140-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Rimadyl</td>
			<td>Pfizer animal health</td>
			<td>24751</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="118">
			<td height="138" rowspan="2">moisture ointment - Synthomycine 5%</td>
			<td rowspan="2">Rekah Pharmaceutical</td>
			<td rowspan="2">195</td>
			<td rowspan="2"> </td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">histoacryl</td>
			<td>Braun</td>
			<td>112101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotactic injection of microrna-expressing lentiviruses to the mouse hippocampus ca1 region and assessment of the behavioral outcome

Los microARN (miRNA) son pequeñas moléculas de ARN de cadena simple reguladoras unos 22 nucleótidos de longitud que pueden cada destino numerosas transcripciones de ARNm y dim toda una expresión de los genes de la vía de la destrucción de inducir y / o inhibición de la traducción de estos objetivos. Varios miRNAs juegan un papel clave en el mantenimiento de la estructura y la función neuronal y en las funciones cerebrales de alto nivel, y se buscan métodos para manipular los niveles para explorar estas funciones. A continuación, presentamos un método directo en vivo para el examen de las consecuencias cognitivas de miRNAs forzadas exceso en ratones mediante la inyección estereotáxica de partículas virales miRNA-codificación. Específicamente, el protocolo actual consiste en la inyección en la región CA1 del hipocampo, lo que contribuye a la consolidación de mamífero memoria, el aprendizaje, y las respuestas al estrés, y ofrece un lugar de la inyección conveniente. Las coordenadas se miden de acuerdo con el bregma ratón y virus de la perfusión se controla y se mantiene muy lento digitalmente.Después de la inyección, la herida de la cirugía se cierra herméticamente y los animales recuperarse. Los lentivirus que codifican silenciadores de los objetivos de mRNA correspondientes sirven para implicar a la interacción específica de los genes miARN / target responsable del efecto observado, con los ratones no tratados, los ratones inyectados con solución salina y ratones inyectados con vectores lentivirus &quot;vacías&quot; como controles. Un mes después de la inyección, los animales se examinan en el laberinto de agua de Morris (MWM) para la evaluación de su aprendizaje navegación y capacidades de la memoria. El MWM es un tanque redondo lleno de agua coloreada con una pequeña plataforma sumergida 1 cm por debajo de la superficie del agua. Señales visuales estable alrededor del tanque para permitir la navegación espacial (sonido y el campo magnético de la tierra también puede ayudar a los animales en la navegación). Vigilancia de la cámara de vídeo permite la medición de la ruta de la natación y el tiempo para encontrar y constituir la plataforma. El ratón se enseña por primera vez que el montaje de la plataforma escondida ofrece un escape de la natación forzada, sino que se prueba para el uso de este escape y finalmente, la plataforma se retira y las pruebas de la sonda examinar si el ratón recuerda su ubicación anterior. Pruebas repetidas durante varios días consecutivos destacan un mejor rendimiento de los ratones examinados en latencias más cortas para encontrar y montar la plataforma, y ​​las rutas que más directas para llegar a la plataforma o la ubicación. Si no se presenta dicha mejora representa problemas de aprendizaje y de la memoria y / o ansiedad, que puede entonces ser probado específicamente (por ejemplo, en el laberinto elevado en cruz). Este enfoque permite la validación de miRNAs específicos y las transcripciones de destino en lo cognitivo estudiado y / o procesos relacionados con el estrés.

La inyección de 0,5 l lentivirus en la región CA1 en el hipocampo del ratón, con la velocidad de flujo se indica en la sección de protocolo produce una esfera infectada de alrededor de 1 mm en el eje rostral caudal, y alrededor de 0,5 mm en la dirección medial-lateral y la parte anterior -posterior ejes (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50170/50170fig1.jpg" /> Figura 1. Punto de bregma y aparato de ...

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Los microARNs tienen funciones importantes en la estructura y función del cerebro. Aquí se describe un método para hacer cumplir miRNA hipocampo sobreexpresión mediante inyección estereotáxica de un lentivirus que expresan los genes miARN ingeniería. Este enfoque puede servir como una manera relativamente rápida para evaluar la<em&gt; In vivo</em&gt; Efectos de miRNAs sobreexpresados ​​en regiones específicas del cerebro.

Inyección estereotáctica de microARN que expresan lentivirus al ratón hipocampo CA1 Región y evaluación de los resultados del comportamiento

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

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