Name: stereotactic injection of microrna-expressing lentiviruses to the mouse hippocampus ca1 region and assessment of the behavioral outcome
Uploaded: 2013-06-10T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome Video at JoVE.com

Denna studie har fått stöd av Edmond och Lily Safra Center for Brain Sciences (SB gemenskap), The Legacy Heritage Biomedical Science Partnership Program i Israel Science Foundation (Grant nr 378/11, till HS) och den tyska israeliska Foundation for Scientific Forskning och utveckling (GIF) (Grant No 1093-32.2/2010, till HS).

Ett. Lentivirus Framställning <ol><li> Grow HEK-293FT celler till 90% konfluens. </li><li> På dagen för transfektion förändring cellmedium till serumfritt DMEM kompletterat med 1 mM glutamin och 50 mg / ml penicillin-streptomycin. </li><li> Co-transfektera cellerna med en pLKO.1-Puro vektor och med plasmider som kodar för delta-R8.2 och VSV-G-grupper och miRNA av intresse, med användning av 10 pl av 1 mg / ml polyetylenimin som bärare 9. </li><li> Samla förpackade lentivirus vid 24 h och 48 h efter...

<ol>
	<li>Siegel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+screen+implicates+microRNA-138-dependent+regulation+of+the+depalmitoylation+enzyme+APT1+in+dendritic+spine+morphogenesis.">A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis.</a> Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).</li><li>Jin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+genetic+interaction+between+the+fragile+X+mental+retardation+protein+and+the+microRNA+pathway.">Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway.</a> Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).</li><li>Simon, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+miR-1+regulates+a+MEF-2-dependent+retrograde+signal+at+neuromuscular+junctions.">The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions.</a> Cell. 133, 903-915 (2008).</li><li>Consiglio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+therapy+of+metachromatic+leukodystrophy+by+lentiviral+vectors:+correction+of+neuropathology+and+protection+against+learning+impairments+in+affected+mice.">In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice.</a> Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).</li><li>Jakobsson, J., Lundberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+for+use+in+the+central+nervous+system.">Lentiviral vectors for use in the central nervous system.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).</li><li>Berson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic-associated+loss+of+hnRNP-A/B+in+Alzheimer's+disease+impairs+cortical+splicing+and+cognitive+function+in+mice.">Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer's disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice.</a> EMBO Molecular Medicine. , (2012).</li><li>Haramati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+as+repressors+of+stress-induced+anxiety:+the+case+of+amygdalar+miR-34.">MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).</li><li>Shaltiel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+microRNA-132+mediates+stress-inducible+cognitive+deficits+through+its+acetylcholinesterase+target.">Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target.</a> Brain Structure &amp; Function. , 10-1007 (2012).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).</li><li>Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+HIV-+or+FIV-based+lentivector+expression+constructs+&amp;+transduction+of+VSV-G+pseudotyped+viral+particles.">Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs &amp; transduction of VSV-G pseudotyped viral particles.</a> J. Vis. Exp. (62), e3171 (2012).</li><li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morris+Water+Maze+Experiment.">Morris Water Maze Experiment.</a> J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).</li><li>Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morris+water+maze+test+for+learning+and+memory+deficits+in+Alzheimer's+disease+model+mice.">Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice.</a> J. Vis. Exp. (53), e2920 (2011).</li><li>Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+approach+for+intracerebroventricular+delivery.">Genetic approach for intracerebroventricular delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).</li></ol>

Stereotaktisk injektion av en lentivirus är en relativt snabb metod för in vivo-bedömningar för både upp-eller nedreglering av olika gener och miRNA. Det främsta alternativet är en genetiskt modifierad mus som är en mycket mer mödosam och tidskrävande teknik sedan direkt lentivirus injektion. Dessutom uppreglering i lentivirus injektion, sker vid en viss tidpunkt i vuxen mus och omfattar inte någon möjlighet till läckage under utveckling, så är det oftast så i genetiskt modifierade möss som ink...

Rollen av särskilda miRNA i nervsystemet funktion har nyligen ifrågasatts av lentiviral injektion i flera studier. MiRNA har visat sig vara avgörande för att upprätthålla och omforma synaps struktur 1, synaptogenesis 2 och synaps ombyggnad och underhåll 3. Dessa studier tyder starkt på att miRNA är engagerade, via multileveled reglerande effekter i både forma upp och bevara huvudutgång av nervsystemet, kognitiv funktion. Stereotaktisk injektion av lentivirus partiklar i specifika regioner i gnagare hjärnan kan söka efter förändringar i synaps morfologi och neuronal aktivitet, och användes för att fastställa den funktionella betydelsen av över-uttryckta transkript 4,5. Direkt smitta av nervceller vid väldefinierade hjärnområden med miRNA-uttryckande lentiviruses kan vara inblandad i studier av åldrande, sjukdomar i hjärnan och neurodegeneration, Studier av miRNAs i sfären av beteendemässiga reglering 6-8 är på en betydligt mindre framskridet, och stereotaktisk injektion av miRNA-uttryckande lentivirus partiklar följt av beteendemässiga tester kan vara användbara för sådana ändamål. En betydligt mer arbetskrävande metod för att framkalla över-eller under-uttryck inbegriper genetiskt knock-in eller möss knockout. Genetiska system kan vidare medge villkorat och temporal kontroll på uttrycket (t.ex. Cre-Lox, Tet-system), men dessa knappast erbjuda den rumsliga specificitet injektionen och det finns nästan alltid ett visst mått av läckage. Dessutom kräver de tekniska förfarandena inte kirurgi och kan användas över laboratorier med relativt god reproducerbarhet, men de är långsammare och kräver mycket mer arbetskraft och ekonomiska resurser. Dessutom, den temporal kontroll över-eller under-uttryck i injicerade möss är betydligt mer exakt jämfört med genetiskt modifierade möss.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="748">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Rodent weigh scale</td>
			<td>Burtons (UK)</td>
			<td>115-455</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24">heating pad</td>
			<td>FIRstTechnology</td>
			<td>DCT-25</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">trimming machine</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51465</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">stereotact</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51730</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Scalpel and blades</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td>INS500348</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Harland syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7632-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">driller</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51449</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">digital pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>704507</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Water tank and platform</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>60135</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="682">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">ketamine </td>
			<td>Vetoquinol(Lure France)</td>
			<td>3055503</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">domitor</td>
			<td>Orion pharma</td>
			<td>107140-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Rimadyl</td>
			<td>Pfizer animal health</td>
			<td>24751</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="118">
			<td height="138" rowspan="2">moisture ointment - Synthomycine 5%</td>
			<td rowspan="2">Rekah Pharmaceutical</td>
			<td rowspan="2">195</td>
			<td rowspan="2"> </td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">histoacryl</td>
			<td>Braun</td>
			<td>112101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotactic injection of microrna-expressing lentiviruses to the mouse hippocampus ca1 region and assessment of the behavioral outcome

MicroRNAs (miRNA) är små reglerande enda RNA-molekyler omkring 22 nukleotider långa, som kan varje avsedd många mRNA-transkript och dämpa en hel genuttryck pathway genom att inducera förstörelse och / eller hämma översättning av dessa mål. Flera miRNA spelar viktiga roller för upprätthållandet av neuronal struktur och funktion och i högre nivå hjärnfunktioner, och metoder söks för att manipulera sina nivåer för att utforska dessa funktioner. Här presenterar vi en direkt in vivo metod för att undersöka de kognitiva konsekvenserna av påtvingade miRNA överskott i möss genom stereotaktisk injektion av miRNA-kodande viruspartiklar. Konkret innebär det nuvarande protokollet injektion i hippocampus CA1 regionen, vilket bidrar till däggdjur minne konsolidering, lärande och stressreaktioner, och erbjuder en bekväm injektionsstället. Koordinaterna mäts enligt musens bregma och virus perfusion styrs digitalt och hållas mycket långsamt.Efter injektion, är operationen såret tillslöts och djuren återhämta sig. Lentiviruses kodar ljuddämpare av motsvarande mRNA målen tjänar till att blanda in den specifika miRNA / mål interaktion som ansvarar för den observerade effekten, med naiva möss, möss som injicerats med koksaltlösning och möss som injicerats med &quot;tomma&quot; lentivirus vektorer som kontroller. En månad efter injektion, djuren undersöks i Morris Water Maze (MWM) för att bedöma deras navigering lärande och förmågor minne. Den MWM är en rund tank fylld med färgat vatten med en liten plattform nedsänkt 1 cm under vattenytan. Steady visuella ledtrådar kring tanken möjliggöra för rumslig navigering (ljud och jordens magnetfält kan också hjälpa djuren att navigera). Video kamera övervakning gör det möjligt att mäta vilken rutt simma och tid att hitta och uppgå plattformen. Musen är först lärde att montera den dolda plattformen erbjuder en flykt från den påtvingade simma, det testas sedan för att använda denna flykt och finally är plattformen avlägsnas och probe test undersöker om musen minns sin tidigare plats. Upprepade tester under flera dagar i följd markerar förbättrad prestanda testade möss vid kortare latenser hitta och montera plattformen, och som mer direkta vägar för att nå plattformen eller dess plats. Underlåtenhet att visa sådan förbättring representerar försämrad inlärning och minne och / eller ångest, vilket sedan kan testas specifikt (t.ex. i förhöjda plus labyrint). Detta tillvägagångssätt möjliggör validering av specifika miRNA och avskrifter mål i studerade kognitiva och / eller stressrelaterade processer.

Injektion av 0,5 pl lentivirus i CA1 regionen i mössens hippocampus, med flödeshastigheten anges i protokollet avsnittet ger en infekterad sfär av ca 1 mm i rostral-caudal axeln, och ca 0,5 mm i den mediala-laterala och främre -bakre axlar (Figur 3). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50170/50170fig1.jpg" /> Figur 1. Bregma punkt och injektionsanordningen. (A) På bilden visas en schematisk karta över Br...

Watch this Scientific Journal Video about Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome Video at JoVE.com

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome Video (Video) | JoVE

MicroRNAs har betydande roller i hjärnans struktur och funktion. Här beskriver vi en metod för att genomdriva hippocampus miRNA överuttryck med stereotaktisk injektion av en konstruerad miRNA-uttryckande lentivirus. Detta tillvägagångssätt kan fungera som ett relativt snabbt sätt att bedöma<em&gt; In vivo</em&gt; Effekter av över-uttryckta miRNA i specifika delar av hjärnan.

Stereotaktisk injektion av MicroRNA-uttryckande Lentiviruses till musen Hippocampus CA1 Region och bedömning av de Behavioral Utfall

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

Research

JoVE Journal

Behavior

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

Behavioral Phenotyping of Murine Disease Models with the Integrated Behavioral Station (INBEST)

Behavioral Phenotyping of Murine Disease Models with the Integrated Behavioral Station INBEST Video (Video) | JoVE

Behavioral Fenotypning av murina Sjukdoms Modeller med integrerad Behavioral Station (INBEST)

Due to rapid advances in genetic engineering, small rodents have become the preferred subjects in many disciplines of biomedical research. In studies of ...

Behavioral Assessment of the Aging Mouse Vestibular System

Behavioral Assessment of the Aging Mouse Vestibular System Video (Video) | JoVE

Behavioral Bedömning av Aging Mouse Vestibular System

Age related decline in balance performance is associated with deteriorating muscle strength, motor coordination and vestibular function. While a number of ...

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience Video (Video) | JoVE

Omfattande Analys av transkription Dynamics från Brain Prover Efter Behavioral Experience

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific ...

Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach

Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach Video (Video) | JoVE

Experimentell Bedömning av mus Sällskaplighet hjälp av en automatiserad bildbehandling Approach

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the ...

Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors

Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors Video (Video) | JoVE

Tillämpa stereotaktisk injektion teknik för att studera genetiska effekter på djurens beteenden

Stereotactic injection is a useful technique to deliver high titer lentiviruses to targeted brain areas in mice. Lentiviruses can either overexpress or ...

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning Video (Video) | JoVE

Vagus nerve stimulation som ett verktyg för att inducera plasticitet i vägar som är relevanta för Extinction Lärande

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been ...

The Rodent Psychomotor Vigilance Test (rPVT): A Method for Assessing Neurobehavioral Performance in Rats and Mice

The Rodent Psychomotor Vigilance Test RPVT: A Method for Assessing Neurobehavioral Performance in Rats and Mice Video (Video) | JoVE

Gnagare Psyko Vigilance Test (rPVT): En metod för bedömning neurobehavioral Performance i råttor och möss

The human Psychomotor Vigilance Test (PVT) is a widely used procedure for measuring changes in fatigue and sustained attention. The present article ...

Behavioral Assessment of Hearing in 2 to 4 Year-old Children: A Two-interval, Observer-based Procedure Using Conditioned Play-based Responses

Behavioral Assessment of Hearing in 2 to 4 Year-old Children: A Two-interval, Observer-based Procedure Using Conditioned Play-based Responses Video (Video) | JoVE

Behavioral Bedömning av utfrågning i 2-4 år gamla barn: två intervall, Observer baserade Förfarande med rade Play-baserade svar

Collecting reliable behavioral data from toddlers and preschoolers is challenging. As a result, there are significant gaps in our understanding of human ...

Measuring Active and Passive Tameness Separately in Mice

Measuring Active and Passive Tameness Separately in Mice Video (Video) | JoVE

Mätning av aktiv och passiv tamhet separat hos möss

Domesticated animals such as dogs and laboratory mice show a high level of tameness, which is important for humans to handle them easily. Tameness has two ...

The Unpredictable Chronic Mild Stress Protocol for Inducing Anhedonia in Mice

The Unpredictable Chronic Mild Stress Protocol for Inducing Anhedonia in Mice Video (Video) | JoVE

Oförutsägbara kronisk Mild Stress protokollet för att inducera likgiltighet hos möss

Depression is a highly prevalent and debilitating condition, only partially addressed by current pharmacotherapies. The lack of response to treatment by ...