Name: stereotactic injection of microrna-expressing lentiviruses to the mouse hippocampus ca1 region and assessment of the behavioral outcome
Uploaded: 2013-06-10T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome Video at JoVE.com

Bu çalışma, Beyin Bilimleri Edmond ve Lily Safra Merkezi (SB dostluk), İsrail Bilim Vakfı (HS Hibe No 378/11,) The Legacy Mirası Biyomedikal Bilim Ortaklık Programı ve Bilimsel için Alman İsrail Vakfı tarafından desteklenmiştir Araştırma ve Geliştirme (GIF) (HS Grant No 1093-32.2/2010,).

1. Lentivirüs Hazırlık <ol><li> % 90 izdiham HEK-293FT hücreleri büyütün. </li><li> Serumsuz DMEM transfeksiyon değişim hücre orta günde 1 mM glutamin, ve 50 mg / ml penisilin-streptomisin ile takviye edilmiş. </li><li> Bir pLKO.1-Puro, vektör ve bir taşıyıcı olarak 9: 1 mg / ml &#39;polietilenimin 10 ul kullanılarak delta R8.2 ve VSV-G grupları ve ilgi MiRNA kodlayan plazmid ile ko-transfekte hücreleri. </li><li> 0.45 mikron filtre ile filtre, 24 saat ve 48 saat sonrası transfeksiyon d...

<ol>
	<li>Siegel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+screen+implicates+microRNA-138-dependent+regulation+of+the+depalmitoylation+enzyme+APT1+in+dendritic+spine+morphogenesis.">A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis.</a> Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).</li><li>Jin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+genetic+interaction+between+the+fragile+X+mental+retardation+protein+and+the+microRNA+pathway.">Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway.</a> Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).</li><li>Simon, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+miR-1+regulates+a+MEF-2-dependent+retrograde+signal+at+neuromuscular+junctions.">The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions.</a> Cell. 133, 903-915 (2008).</li><li>Consiglio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+therapy+of+metachromatic+leukodystrophy+by+lentiviral+vectors:+correction+of+neuropathology+and+protection+against+learning+impairments+in+affected+mice.">In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice.</a> Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).</li><li>Jakobsson, J., Lundberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+for+use+in+the+central+nervous+system.">Lentiviral vectors for use in the central nervous system.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).</li><li>Berson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic-associated+loss+of+hnRNP-A/B+in+Alzheimer's+disease+impairs+cortical+splicing+and+cognitive+function+in+mice.">Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer's disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice.</a> EMBO Molecular Medicine. , (2012).</li><li>Haramati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+as+repressors+of+stress-induced+anxiety:+the+case+of+amygdalar+miR-34.">MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).</li><li>Shaltiel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+microRNA-132+mediates+stress-inducible+cognitive+deficits+through+its+acetylcholinesterase+target.">Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target.</a> Brain Structure &amp; Function. , 10-1007 (2012).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).</li><li>Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+HIV-+or+FIV-based+lentivector+expression+constructs+&amp;+transduction+of+VSV-G+pseudotyped+viral+particles.">Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs &amp; transduction of VSV-G pseudotyped viral particles.</a> J. Vis. Exp. (62), e3171 (2012).</li><li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morris+Water+Maze+Experiment.">Morris Water Maze Experiment.</a> J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).</li><li>Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morris+water+maze+test+for+learning+and+memory+deficits+in+Alzheimer's+disease+model+mice.">Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice.</a> J. Vis. Exp. (53), e2920 (2011).</li><li>Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+approach+for+intracerebroventricular+delivery.">Genetic approach for intracerebroventricular delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).</li></ol>

Bir lentivirüs stereotaktik enjeksiyon için hem yukarı veya farklı genler ve miRNA&#39;lar yük atma in vivo değerlendirme için nispeten hızlı bir yöntemdir. Başlıca alternatif daha sonra çok daha zahmetli ve zaman alan bir tekniktir lentivirüs doğrudan enjeksiyon, bir genetik faredir. Buna ek olarak, yukarı regülasyonu, lentivirüs enjeksiyon, yetişkin fare belirli bir zamanda meydana gelir ve çoğu zaman geçici denetimi genetiği farelerde olduğu gibi, geliştirme sırasında sızdırma ol...

Sinir sisteminin işleyişinde özellikle miRNA&#39;lar rolü son zamanlarda birçok çalışmada lentiviral enjeksiyon meydan olmuştur. MiRNA sinaps yapısı 1, sinaptogenez 2 ve sinaps yeniden ve bakım 3 bakımı ve yeniden şekillendirme için çok önemli olduğu tespit edilmiştir. Bu çalışmalar güçlü bir yukarı şekillendirme hem de sinir sistemi, bilişsel fonksiyon ana çıkış korunmasında çok katmanlı düzenleyici etkileri ile, miRNA&#39;lar meşgul olduğunu göstermektedir. Kemirgen beynindeki belirli bölgeleri lentivirüs parçacıkların stereotaktik enjeksiyon sinaps morfolojisi ve nöronal aktivite Değişiklik için arama sağlar ve 4,5-aşırı ifade transkript fonksiyonel önemi kurulması için kullanılmıştır. MiRNA-ifade lentivirüsler ile iyi tanımlanmış beyin alanlarda nöronların doğrudan enfeksiyon yaşlanma, beyin hastalıkları ve nörodejenerasyon çalışmalarında karışmış olabilir; miRNA Çalışmalarıs davranışsal düzenleme 6-8 dünyasında bir çok daha az gelişmiş devlet altındadır, ve stereotaktik enjeksiyon miRNA-ifade davranış testleri takip lentivirüs parçacıklar gibi amaçlar için yararlı olabilir. Aşırı ya da az ifade uyaran için çok daha zahmetli yöntemi genetik knock-in veya farelerde mühendislik içerir. Genetik sistemleri daha da ifade koşullu ve zamansal kontrolünün (örneğin, Kre-Lox, Tet sistemler) için izin verebilir, ancak bu pek bir enjeksiyon işlemi uzamsal özgüllüğünü sunmak ve sızdırma bir miktar hemen hemen her zaman bulunmamaktadır. Ayrıca, mühendislik yöntemleri ameliyat gerektirmeyen ve nispeten iyi tekrarlanabilirlik ile laboratuvarlar arasında kullanılabilir, ancak onlar daha yavaş ve çok daha fazla insan gücü ve mali kaynak gerektirir. Buna ek olarak, kontrol geçici aşırı ya da enjekte edilmiş farelerde altında ekspresyonu genetik farelere kıyasla çok daha doğru olacaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="748">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Rodent weigh scale</td>
			<td>Burtons (UK)</td>
			<td>115-455</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24">heating pad</td>
			<td>FIRstTechnology</td>
			<td>DCT-25</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">trimming machine</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51465</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">stereotact</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51730</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Scalpel and blades</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td>INS500348</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Harland syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7632-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">driller</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51449</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">digital pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>704507</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Water tank and platform</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>60135</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="682">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">ketamine </td>
			<td>Vetoquinol(Lure France)</td>
			<td>3055503</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">domitor</td>
			<td>Orion pharma</td>
			<td>107140-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Rimadyl</td>
			<td>Pfizer animal health</td>
			<td>24751</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="118">
			<td height="138" rowspan="2">moisture ointment - Synthomycine 5%</td>
			<td rowspan="2">Rekah Pharmaceutical</td>
			<td rowspan="2">195</td>
			<td rowspan="2"> </td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">histoacryl</td>
			<td>Braun</td>
			<td>112101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotactic injection of microrna-expressing lentiviruses to the mouse hippocampus ca1 region and assessment of the behavioral outcome

MicroRNA (miRNA&#39;lar) uzun 22 nükleotid çevresinde küçük düzenleyici tek zincirli RNA molekülleri olduğunu olabilir her hedef çok sayıda mRNA transkript ve neden olan yıkım ve / veya bu hedeflere inhibe çeviri tarafından loş bütün bir gen yolu. Çeşitli miRNA&#39;lar nöronal yapı ve fonksiyonu sürdürmek ve üst düzey beyin fonksiyonlarında önemli rol oynayan ve yöntemleri bu işlevler keşfetmek için kendi seviyelerini değiştirmek için aranır. Burada, MiRNA kodlayan virüs partiküllerinin stereotaktik enjeksiyon yoluyla uygulanan farelerde aşırı miRNAs bilişsel sonuçları incelemek için in vivo metot, doğrudan mevcut. Özellikle, mevcut protokol memeli bellek konsolidasyon, öğrenme ve stres yanıtları katkıda bulunur ve uygun bir enjeksiyon yeri sunmaktadır hipokampal CA1 bölgesinde, içine enjeksiyon içerir. Koordinatları fare bregma ve virüs perfüzyon dijital kontrollü ve çok yavaş tutulur göre ölçülür.Enjeksiyon sonrası, cerrahi yara kapalı ve hayvanların kurtarmak olduğunu. Ilgili mRNA hedeflerin susturucular kodlama lentivirüsler naif fare ile, gözlenen etkisi sorumlu özel miRNA / hedef etkileşimi ima hizmet, tuzlu ve kontrol grubu olarak &quot;boş&quot; lentivirüs vektörleri enjekte fareler enjekte fareler. Bir ay sonrası enjeksiyon, hayvanlar kendi navigasyon öğrenme ve bellek yeteneklerini değerlendirmek için Morris Su Maze (MWM) incelenmiştir. MWM 1 cm su yüzeyinin altında batık küçük bir platformu ile renkli su dolu yuvarlak bir tank. Tankın etrafında sabit görsel ipuçları mekansal navigasyon (ses ve dünyanın manyetik alanı da navigasyon hayvanlar yardımcı olabilir) için izin verir. Video kamera izleme bulmak ve platform miktar için yüzme ve zaman yol ölçüm sağlar. Fare ilk gizli montaj platformu zorla yüzme bir kaçış sunuyor öğretilir, daha sonra bu kaçış ve f kullanmak için test edilirinally, platform kaldırılır ve fare önceki konumuna hatırlar eğer prob testleri incelemektir. Birkaç gün üst üste tekrar tekrar test platformu bulmak ve monte etmek daha kısa gecikmeleri test farelerin gelişmiş performans vurgulamak ve daha direkt hatları platform ya da konumu ulaşmak için. Bu gelişme daha sonra (yükseltilmiş artı labirent gibi) özel olarak test edilebilir bozulmuş öğrenme ve bellek ve / veya anksiyete, temsil göstermek için başarısız. Bu yaklaşım, bilişsel eğitim ve / veya stres ile ilgili işlemlerde özel miRNAs ve hedef transkript doğrulama sağlar.

Protokol bölümünde belirtilen debi ile fare hipokampta CA1 bölgesinde, içine 0.5 ul lentivirüs enjeksiyon rostral-kaudal ekseninde yaklaşık 1 mm enfekte bir küre verir ve 0.5 medial yan mm ve ön ile ilgili -arka eksen (Şekil 3). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50170/50170fig1.jpg" /> Şekil 1. Bregma noktası ve enjeksiyon cihazı. (A) gösterilir bregma (koronal ve sagital sütür kavşak) ve ...

Watch this Scientific Journal Video about Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome Video at JoVE.com

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome Video (Video) | JoVE

MicroRNA beyin yapısı ve fonksiyonu önemli rolleri vardır. Burada aşırı ifadesi bir mühendislik miRNA-ifade lentivirüs stereotaktik enjeksiyonu kullanılarak hipokampal miRNA uygulamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, değerlendirmek için nispeten hızlı bir yöntem olarak hizmet verebilir<em&gt; In vivo</em&gt; Spesifik beyin bölgelerinde aşırı ifade miRNAs etkisi.

Bir Stereotaktik Enjeksiyon MicroRNA-ifade Fare Hippocampus CA1 Bölgesi Lentiviruses ve Davranış Sonuç Değerlendirilmesi

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

Research

JoVE Journal

Behavior

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

Behavioral Phenotyping of Murine Disease Models with the Integrated Behavioral Station (INBEST)

Behavioral Phenotyping of Murine Disease Models with the Integrated Behavioral Station INBEST Video (Video) | JoVE

Entegre Davranış İstasyonu ile Kemirgen Hastalık Modellerinin Davranış Fenotiplendirme (INBEST)

Due to rapid advances in genetic engineering, small rodents have become the preferred subjects in many disciplines of biomedical research. In studies of ...

Behavioral Assessment of the Aging Mouse Vestibular System

Behavioral Assessment of the Aging Mouse Vestibular System Video (Video) | JoVE

Yaşlanma Fare Vestibüler Sistemi Davranışsal Değerlendirme

Age related decline in balance performance is associated with deteriorating muscle strength, motor coordination and vestibular function. While a number of ...

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience Video (Video) | JoVE

Davranış Deneyim ardından Beyin Örneklerden Deşifre Dynamics Kapsamlı Analizi

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific ...

Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach

Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach Video (Video) | JoVE

Bir Otomatik Görüntü İşleme Yaklaşımı ile Fare Sosyallik Deneysel Değerlendirilmesi

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the ...

Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors

Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors Video (Video) | JoVE

Stereotaktik Enjeksiyon Tekniği uygulamak Hayvan Davranışları üzerinde Genetik Etkileri Eğitim için

Stereotactic injection is a useful technique to deliver high titer lentiviruses to targeted brain areas in mice. Lentiviruses can either overexpress or ...

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning Video (Video) | JoVE

Aracı Olarak vagus sinir stimülasyonu Extinction Öğrenme İlgili Pathways Plastisitesi tetikleyebilecek

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been ...

The Rodent Psychomotor Vigilance Test (rPVT): A Method for Assessing Neurobehavioral Performance in Rats and Mice

The Rodent Psychomotor Vigilance Test RPVT: A Method for Assessing Neurobehavioral Performance in Rats and Mice Video (Video) | JoVE

Kemirgen Psikomotor teyakkuz Testi (rPVT): Sıçan ve Farelerde Nörodavranışsal Performans değerlendirilmesi için bir yöntem

The human Psychomotor Vigilance Test (PVT) is a widely used procedure for measuring changes in fatigue and sustained attention. The present article ...

Behavioral Assessment of Hearing in 2 to 4 Year-old Children: A Two-interval, Observer-based Procedure Using Conditioned Play-based Responses

Behavioral Assessment of Hearing in 2 to 4 Year-old Children: A Two-interval, Observer-based Procedure Using Conditioned Play-based Responses Video (Video) | JoVE

4 Yaşındaki Çocuklara 2&#39;de İşitme Davranışsal Değerlendirme: A İki aralık, Gözlemci tabanlı Prosedür Koúullanmıú Play-tabanlı Yanıtları kullanma

Collecting reliable behavioral data from toddlers and preschoolers is challenging. As a result, there are significant gaps in our understanding of human ...

Measuring Active and Passive Tameness Separately in Mice

Measuring Active and Passive Tameness Separately in Mice Video (Video) | JoVE

Aktif ve pasif Tameness ayrı olarak farelerde ölçme

Domesticated animals such as dogs and laboratory mice show a high level of tameness, which is important for humans to handle them easily. Tameness has two ...

The Unpredictable Chronic Mild Stress Protocol for Inducing Anhedonia in Mice

The Unpredictable Chronic Mild Stress Protocol for Inducing Anhedonia in Mice Video (Video) | JoVE

Anhedonia farelerde Inducing için öngörülemeyen kronik hafif stres Protokolü

Depression is a highly prevalent and debilitating condition, only partially addressed by current pharmacotherapies. The lack of response to treatment by ...