Name: generation of stable human cell lines with tetracycline-inducible (tet-on) shrna or cdna expression
Uploaded: 2013-03-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible Tet-on shRNA or cDNA Expression at JoVE.com

نشكر جميع أعضاء مختبرنا لإجراء مناقشات مفيدة. نشكر جوانا Lisztwan وGewinner كريستينا لقراءة نقدية للمخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل BB/I021248/1 منحة BBSRC ويلكوم ترست منحة 090090/Z/09/ZAH هو البحث يلكوم ترست الوظيفي زميل التنمية في معهد السرطان UCL.

1. استنساخ pcDNA6_TetR_IRES_blast <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما هو موضح في الشكل (3)، نفذ خلاصة جزئية للpcDNA6/TR بلازميد (V1025-20، إينفيتروجن) مع I تقييد الانزيمات وXba راس I لإزالة الجين TetR والمروج للمقاومة blasticidin (BlastR) الجينات. عزل ناقلات KB 4،6 جزء. </li><...

<ol>
	<li>Postle, K., Nguyen, T. T., Bertrand, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence+of+the+repressor+gene+of+the+TN10+tetracycline+resistance+determinant.">Nucleotide sequence of the repressor gene of the TN10 tetracycline resistance determinant.</a> Nucleic Acids Res. 12, 4849-4863 (1984).</li><li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters.">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5547-5551 (1992).</li><li>Gossen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+activation+by+tetracyclines+in+mammalian+cells.">Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells.</a> Science. 268, 1766-1769 (1995).</li><li>Elbashir, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells.">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li><li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells.">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550-553 (2002).</li><li>McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+using+micro-RNA+designed+hairpins.">Gene silencing using micro-RNA designed hairpins.</a> RNA. 8, 842-850 (2002).</li><li>Miyagishi, M., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U6+promoter-driven+siRNAs+with+four+uridine+3'+overhangs+efficiently+suppress+targeted+gene+expression+in+mammalian+cells.">U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).</li><li>Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J., Conklin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+hairpin+RNAs+(shRNAs)+induce+sequence-specific+silencing+in+mammalian+cells.">Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells.</a> Genes Dev. 16, 948-958 (2002).</li><li>Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+expression+of+small+interfering+RNA+in+human+cells.">Effective expression of small interfering RNA in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).</li><li>Sui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+vector-based+RNAi+technology+to+suppress+gene+expression+in+mammalian+cells.">A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).</li><li>Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+by+expression+of+short-interfering+RNAs+and+hairpin+RNAs+in+mammalian+cells.">RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 6047-6052 (2002).</li><li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+gene+expression+using+a+stably+integrated,+inducible+small-interfering-RNA+vector.">Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector.</a> EMBO Rep. 4, 609-615 (2003).</li><li>Hergovich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MST1+and+hMOB1+tumor+suppressors+control+human+centrosome+duplication+by+regulating+NDR+kinase+phosphorylation.">The MST1 and hMOB1 tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation.</a> Curr. Biol. 19, 1692-1702 (2009).</li><li>Hergovich, A., Lamla, S., Nigg, E. A., Hemmings, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome-associated+NDR+kinase+regulates+centrosome+duplication.">Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication.</a> Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).</li><li>Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+NDR/LATS+interactions+with+the+human+MOB+family+reveal+a+negative+role+for+human+MOB2+in+the+regulation+of+human+NDR+kinases.">Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases.</a> Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).</li><li>Vichalkovski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NDR+kinase+is+activated+by+RASSF1A/MST1+in+response+to+Fas+receptor+stimulation+and+promotes+apoptosis.">NDR kinase is activated by RASSF1A/MST1 in response to Fas receptor stimulation and promotes apoptosis.</a> Curr. Biol. 18, 1889-1895 (2008).</li><li>Pear, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr/abl-transduced+bone+marrow.">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li></ol>

نعتقد أن على أنظمة تيت يسهل إلى حد كبير في تحليل وظائف الجينات، ولا سيما في نظم الخلايا التي يصعب التلاعب و / أو عندما يكون الجين التلاعب أمر ضروري لبقاء الخلية. وعلاوة على ذلك، فإن القدرة على التحكم في التعبير الجيني من قبل أنظمة تيت على محددة للغاية يتيح الفرصة لدراس...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> الجنين المصل البقري (FBS) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 16000-044 </td><td> اختبار تيت خالية </td></tr><tr><td> Blasticidin </td><td> Invivogen </td><td> النمل BL-1 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> Invivogen </td><td> النمل والزنك-5 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> PAA المختبرات </td><td> P31-011 </td><td> 100 ملغ / مل في وسائل الإعلام </td></tr><tr><td> مكافحة TET02 </td><td> MoBiTec شركة محدودة </td><td> TET02 </td><td> استخدام في 1/1000 إلى 2000/1 لWB </td></tr><tr><td> pcDNA6/TR </td><td> إينفيتروجن </td><td> V1025-20 </td><td></td></tr><tr><td> PT-ريكس DEST30 </td><td> إينفيتروجن </td><td> 12301-016 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> التتراسيكلين </td><td> سيجما </td><td> 87128 </td><td> 2 ملغ / مل في الإيثانول </td></tr><tr><td> الدوكسيسيكلين </td><td> سيجما </td><td> D9891 </td><td> 2 ملغ / مل في الماء </td></tr><tr><td> استنساخ الاسطوانات </td><td> Bellco زجاج شركة </td><td> 2090-00808 </td><td> إعادة صالحة للاستخدام </td></tr></tbody></table>

generation of stable human cell lines with tetracycline-inducible (tet-on) shrna or cdna expression

A نهج الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلية الثديية هو التلاعب في التعبير عن الجينات ذات الأهمية في خطوط الخلايا المحددة، وذلك بهدف الكشف عن واحد أو عدة من وظيفة الجين (ق) باستخدام overexpression عابر / مستقر أو ضربة قاضية من الجين من الفائدة. للأسف، لإجراء تحقيقات الخلية البيولوجية المختلفة هذا النهج غير مناسب عندما تلاعب بنتيجة التعبير الجيني في النمو العيوب / تكاثر الخلايا غير المرغوب فيها أو تمايز الخلايا. ولذلك، تكيفت الباحثون بروتين التتراسيكلين كاظمة (TetR)، المأخوذ من E. القولونية المقاومة التتراسيكلين OPERON 1، لتوليد نظم تنظيمية فعالة جدا وضيقة للتعبير عن cDNAs في خلايا الثدييات 2،3. وباختصار، تم تعديل TetR لبدء إما كتلة (1) من النسخ عن طريق الربط إلى تيت-المشغل (TO) في منطقة المروج إضافة إلى التتراسيكلين (وهو ما يسمى تيت حالا النظام) أو ربط (2) إلى TO في رانه غياب التتراسيكلين (وهو ما يسمى تيت على نظام) (الشكل 1). نظرا للإزعاج أن النظام تيت لمرة ويتطلب استمرار وجود التتراسيكلين (التي لديها نصف عمر حوالي 24 ساعة في الخلية الأنسجة ثقافة المتوسط) وتيت على نظام تم على نطاق واسع أكثر الأمثل، مما أدى إلى تطوير ضيق جدا ونظم فعالة لمكافحة ناقلات التعبير كما هو مستخدم هنا [كدنا]. بعد وقت قصير من إنشاء تدخل الحمض النووي الريبي (رني) لضربة قاضية الجينات في خلايا الثدييات 4، معربا ناقلات قصيرة دبوس الشعر الرناوات (shRNAs) وصفت تلك الوظيفة مشابهة جدا لsiRNAs 5-11. ومع ذلك، هذه النهج ضربة قاضية shRNA بوساطة لها نفس القيد عن استراتيجيات خروج المغلوب التقليدية، منذ استنفاد مستقرة ليس ممكنا عندما الجينات الأهداف ضرورية لبقاء الخلوية. للتغلب على هذا القيد، فان دي Wetering وآخرون 12 تعديل التعبير shRNA ناقلات pSUPER 5 </suع&gt; عن طريق إدراج TO في منطقة المروج، والذي مكنهم من توليد خطوط الخلايا مستقرة مع التتراسيكلين-محرض استنزاف الجينات المستهدفة اهتمامهم. هنا، نحن تصف طريقة لتوليد بكفاءة مستقرة الإنسان تيت على خطوط الخلايا التي تدفع إما موثوق overexpression محرض أو استنزاف الجين في المصالح. باستخدام هذه الطريقة، ونحن قد ولدت بنجاح تيت على خطوط الخلايا التي سهلت كثيرا من تحليل سلسلة MST / hMOB / NDR في الجسيم المركزي 13،14 15،16 إشارة وموت الخلايا المبرمج. في هذا التقرير، ونحن لدينا وصف ناقلات الاختيار، بالإضافة إلى وصف خطوتين متتاليتين التلاعب والتي هي ضرورية لتوليد بكفاءة الإنسان تيت على خطوط الخلايا (الشكل 2). وعلاوة على ذلك، إلى جانب وضع الخطوط العريضة لبروتوكول لتوليد تيت الإنسان على خطوط الخلايا، سوف نناقش الجوانب الحاسمة بشأن الإجراءات الفنية وتوصيف تيت على الخلايا.

يتم عرض مثال لتوصيف الأولي للRPE-1 خطوط الخلايا معربا عن ثابت TetR في الشكل 4. علما أن جميع الحيوانات المستنسخة RPE-1 تعبر عن مستويات متفاوتة من TetR (قارن ممرات 2 و 5)، في حين أن خط الخلية الأبوية (التي هي بمثابة المراقبة السلبية) لا يعبر عن البروتين TetR الخارجية (الش...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible Tet-on shRNA or cDNA Expression at JoVE.com

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible Tet-on shRNA or cDNA Expression

وهناك طريقة سريعة وبسيطة لتوليد خطوط الخلايا البشرية مع محرض و overexpression [كدنا] أو عكسها shRNA بوساطة ضرب أسفل من الجينات في المصالح. هذه الطريقة تمكن الباحثين من خطوط الخلايا موثوق للغاية والتلاعب بتكاثر التي يصعب تغيير بالطرق التقليدية ترنسفكأيشن عابرة أو ضربة قاضية استراتيجيات / خروج المغلوب.

جيل من خطوط الخلايا البشرية مستقرة مع shRNA (تيت-on) التتراسيكلين أو محرض التعبير [كدنا]

A major approach in  the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of  genes of interest in selected cell lines, with the aim ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.

الأشكال الركض الجذعية الجنينية البشرية خلية خطوط مع التربسين

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts ...

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

توليد مستقرة ايليجانس جيم المعدلة وراثيا عن طريق Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Generation of Human CD40-activated B cells

جيل من الخلايا البشرية باء تنشيط CD40

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

عزل الحمض النووي الريبي من الجنينية التجميعي واسماك الزرد [كدنا] لتحليل الجينات

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

باستخدام الجينات Electroporation MXcell بولسير النظام لTransfect الخلايا الأولية ذات الكفاءة العالية

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

باستخدام خلية مكافحة الآلي لتبسيط دراسات التعبير الجيني : ضربة قاضية سيرنا من IL - 4 التعبير الجيني في الخلايا التابعة Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Transduction of Human Cells with Polymer-complexed Ecotropic Lentivirus for Enhanced Biosafety

تنبيغ من خلايا الإنسان مع البوليمر المعقد Ecotropic الفيروسة البطيئة للسلامة الأحيائية المحسن

Stem and tumor cell biology studies often require viral transduction of human cells with known or suspected oncogenes, raising major safety issues for ...