Name: generation of stable human cell lines with tetracycline-inducible (tet-on) shrna or cdna expression
Uploaded: 2013-03-05T13:00:00
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우리는 도움이 논의에 대한 우리 연구실의 모든 구성원을 감사드립니다. 우리는 원고의 중요한 읽기 안나 Lisztwan과 크리스티나 Gewinner 감사드립니다. 이 작품은 BBSRC 기금 BB/I021248/1 지원하고 웰컴 트러스트 부여 090090/Z/09/ZAH은 UCL 암 연구소에서 웰컴 트러스트 연구 경력 개발 동료가되었습니다.

1. pcDNA6_TetR_IRES_blast의 복제 <ol><li> 그림 3에 도시 된 바와 같이, 제한 효소 Xba I 및 NCO 나는 TetR 유전자와 blasticidin 저항 (BlastR) 유전자의 프로모터를 제거 할 수있는 플라스미드 pcDNA6/TR (V1025-20, Invitrogen)의 일부 다이제스트를 수행합니다. 4.6 킬로바이트 벡터 조각을 분리합니다. </li><li> TetR 유전자에서 polyadenylation 순서를 제거하려면 Xho I 사이트는 즉시 TetR의 정지 ?...

<ol>
	<li>Postle, K., Nguyen, T. T., Bertrand, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence+of+the+repressor+gene+of+the+TN10+tetracycline+resistance+determinant.">Nucleotide sequence of the repressor gene of the TN10 tetracycline resistance determinant.</a> Nucleic Acids Res. 12, 4849-4863 (1984).</li><li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters.">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 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R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells.">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550-553 (2002).</li><li>McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+using+micro-RNA+designed+hairpins.">Gene silencing using micro-RNA designed hairpins.</a> RNA. 8, 842-850 (2002).</li><li>Miyagishi, M., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U6+promoter-driven+siRNAs+with+four+uridine+3'+overhangs+efficiently+suppress+targeted+gene+expression+in+mammalian+cells.">U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).</li><li>Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J., Conklin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+hairpin+RNAs+(shRNAs)+induce+sequence-specific+silencing+in+mammalian+cells.">Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells.</a> Genes Dev. 16, 948-958 (2002).</li><li>Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+expression+of+small+interfering+RNA+in+human+cells.">Effective expression of small interfering RNA in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).</li><li>Sui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+vector-based+RNAi+technology+to+suppress+gene+expression+in+mammalian+cells.">A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).</li><li>Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+by+expression+of+short-interfering+RNAs+and+hairpin+RNAs+in+mammalian+cells.">RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 6047-6052 (2002).</li><li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+gene+expression+using+a+stably+integrated,+inducible+small-interfering-RNA+vector.">Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector.</a> EMBO Rep. 4, 609-615 (2003).</li><li>Hergovich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MST1+and+hMOB1+tumor+suppressors+control+human+centrosome+duplication+by+regulating+NDR+kinase+phosphorylation.">The MST1 and hMOB1 tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation.</a> Curr. Biol. 19, 1692-1702 (2009).</li><li>Hergovich, A., Lamla, S., Nigg, E. A., Hemmings, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome-associated+NDR+kinase+regulates+centrosome+duplication.">Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication.</a> Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).</li><li>Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+NDR/LATS+interactions+with+the+human+MOB+family+reveal+a+negative+role+for+human+MOB2+in+the+regulation+of+human+NDR+kinases.">Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases.</a> Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).</li><li>Vichalkovski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NDR+kinase+is+activated+by+RASSF1A/MST1+in+response+to+Fas+receptor+stimulation+and+promotes+apoptosis.">NDR kinase is activated by RASSF1A/MST1 in response to Fas receptor stimulation and promotes apoptosis.</a> Curr. Biol. 18, 1889-1895 (2008).</li><li>Pear, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr/abl-transduced+bone+marrow.">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li></ol>

우리는 Tet-에 시스템이 크게 특히 조작 유전자가 세포 생존에 필수적인 경우 조작 및 / 또는하기가 어렵 전지 시스템에서 유전자 기능의 분석을 용이하게 있다고 생각합니다. 또한, 매우 구체적인 Tet-에 시스템에 의해 유전자 발현을 제어 할 수있는 능력은 다른 단계 (세포주기의 진행이나 ​​잘 정의 된 차별화 프로세스 동안 예를 들어)에 유전자 기능을 연구 할 수있는 기회를 제공합니다. 여기...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 (FBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-044 </td><td> 테스트 Tet 무료 </td></tr><tr><td> Blasticidin </td><td> Invivogen </td><td> 개미-BL-1 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> Invivogen </td><td> 개미 - 아연-5 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> PAA 실험실 </td><td> P31-011 </td><td> 미디어 100 MG / ML </td></tr><tr><td> 안티 TET02 </td><td> MoBiTec GmbH의 </td><td> TET02 </td><td> WB에 1,000분의 1 to 2천분의 1에서 사용 </td></tr><tr><td> pcDNA6/TR </td><td> Invitrogen </td><td> V1025-20 </td><td></td></tr><tr><td> PT-렉스 DEST30 </td><td> Invitrogen </td><td> 12301-016 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> 테트라싸이클린 </td><td> 시그마 </td><td> 87,128 </td><td> 2 밀리그램 / 에탄올에 ML </td></tr><tr><td> Doxycycline </td><td> 시그마 </td><td> D9891 </td><td> 2 밀리그램 / 물에 ML </td></tr><tr><td> 복제 실린더 </td><td> Bellco 유리 주식회사 </td><td> 2090-00808 </td><td> 다시 사용 가능한 </td></tr></tbody></table>

generation of stable human cell lines with tetracycline-inducible (tet-on) shrna or cdna expression

포유류의 세포 생물학 분야의 주요 접근 방식은 공개 할 목적으로, 선택한 셀 라인에 대한 관심의 유전자의 표현의 조작이 하나 이상의 유전자의 과도 / 안정 overexpression 또는 분해를 사용하여 유전자의 기능 (들)의 여러 관심. 불행하게도, 다양한 세포 생물 조사에 대해이 방법은 적합 할 때 세포의 성장 / 확산 결함이나 원치 않는 세포 분화의 유전자 발현 결과의 조작. 따라서, 연구자들은 E.에서 가져온 테트라싸이클린 억제 단백질을 (TetR), 적응 대장균의 테트라 사이클린 내성 오페론 1,2,3 포유류의 세포에 cDNAs을 표현하는 매우 효율적이고 긴밀한 규제 시스템을 생성합니다. 즉, TetR은의 TO에 테트라 사이클린 (Tet - 오프 시스템이라고한다)의 추가시 발기인 지역의 Tet-연산자 (TO)에 바인딩 또는 (2) 바인드에 의해 전사 (1) 블록 개시 하나에 수정되었습니다 티테트라 사이클린의 그 부재 (시스템 Tet 기능이라고한다) (그림 1). Tet - 오프 시스템은 테트라 사이클린의 지속적인 존재를 (이는 조직 세포 배양 매체에 약 24 시간의 반감기가) 필요하다는 불편을 끼쳐 드려 감안할 때 Tet는 -에서 시스템보다 폭이 매우 촉박 개발의 결과, 최적화 된 및 cDNA 표현 효율적인 벡터 시스템은 여기에 사용 된. 바로 짧은 머리 핀의 자형 RNAs (shRNAs)를 표현하는 4 포유류 세포 벡터에서 유전자 최저에 대한 RNA 간섭 (RNAi)의 설립 이후 siRNAs 5-11와 매우 유사한이 기능은 설명했다. 유전자 타겟 세포 생존을 위해 필수적입니다 때 안정적으로 고갈이 적합하지 않을 때문에 그러나, 이러한 shRNA로 인한 최저의 접근 방법은 기존의 한방 전략과 같은 제한이 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 밴 드 Wetering 외. 12 shRNA 표현 벡터 pSUPER에게 수정 5 </su그들에게 관심의 대상 유전자의 테트라 사이클린-inducible 고갈과 안정적인 셀 행을 생성 할 수있게 발기인 지역에에를 삽입하여 P를&gt;. 여기, 우리는 효율적으로 생성하는 방법을 설명 안정된 인간 Tet-inducible에 안정적으로의 overexpression 또는 관심의 유전자의 고갈 중 하나를 운전 세포 라인. 이 방법 사용, 우리는 성공적으로 생성했습니다 Tet-에 크게 중심체 13,14과 15,16 신호를 apoptosis에 산악 표준시 / hMOB / NDR 폭포의 분석을 촉진 세포 라인. 이 보고서에서 우리는 선택의 우리의 벡터를 설명 효율적으로 생성하는 데 필요한 두 개의 연속 조작 단계를 설명뿐만 아니라 인간의 Tet-에 세포 라인 (그림 2). 또한,의 생성을위한 프로토콜을 요약 외에 인간의 Tet-에 세포 라인, 우리는 중요한 기술적 절차에 관한 부분 및 특성화 세포 Tet 기능을 설명합니다.

안정적 TetR을 표현 RPE-1 세포 라인의 초기 특성에 대한 예는 그림 4에 표시됩니다. 부모 셀 라인 (대조군 역할을 함) 외인성 TetR 단백질을 표현하지 않는 동안 모든 RPE-1 클론은 (그림 4 차선 1), (레인 2, 5 비교) TetR의 수준을 다양한 표현합니다. RPE-1 중 TetR 식의이 유사 Tet이 기능 세포 클론 예상되며, plasmids을 표현 TetR의 표현부터 플라스미드 통합 사이트에 크게 의존합니다. ...

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Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible Tet-on shRNA or cDNA Expression

inducible과 관심의 유전자의 치료 cDNA overexpression 또는 shRNA로 인한 똑 다운과 인간의 세포 라인을 생성하기 위해 신속하고 간단한 방법. 이 방법은 일시적 transfection 방법 또는 기존 최저 / 한방 전략에 의해 변경하기가 어렵 안정적으로 높은 reproducibly 조작 세포 라인에 연구자 수 있습니다.

테트라싸이클린-inducible (Tet-에서) shRNA 또는 cDNA 표현과 안정적인 인간 세포 라인의 생성

A major approach in  the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of  genes of interest in selected cell lines, with the aim ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.

트립신과 Passaging 색채 인간의 배아 줄기 세포 - 라인

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts ...

연구

생물학

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Microinjection을 사용하여 안정적인 트렌스​​ 제닉 C. 엘레간스의 생성

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Electroporation에 대한 Murine 골수에서 조혈 세포 차 문화의 준비

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Generation of Human CD40-activated B cells

인간 CD40 - 활성화된 B 세포의 생성

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

유전자 발현 분석을위한 배아 Zebrafish 및 cDNA 합성에서 RNA 격리

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

고효율 기본 셀을 Transfect하는 진 Pulser Electroporation MXcell의 시스템을 사용하여

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

유전자 발현 연구를 단순화하는 자동 셀 카운터를 사용하여 : Namalwa 셀에서 IL - 4 종속 유전자 발현의 siRNA의 최저

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Transduction of Human Cells with Polymer-complexed Ecotropic Lentivirus for Enhanced Biosafety

향상된 Biosafety에 대한 고분자 - complexed Ecotropic Lentivirus과 인간의 세포의 형질 도입

Stem and tumor cell biology studies often require viral transduction of human cells with known or suspected oncogenes, raising major safety issues for ...