Name: evaluation of polymeric gene delivery nanoparticles by nanoparticle tracking analysis and high-throughput flow cytometry
Uploaded: 2013-03-01T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry at JoVE.com

الكتاب أشكر MSCRF TEDCO (2009-MSCRFE-0098-00) وNIH R21CA152473 حصول على الدعم.

1. خلية البذر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تسمح الخلايا لتنمو لoverconfluency. استخدام الخلايا مرور وقت مبكر عندما بنقل العدوى إلى خلايا الأولية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أربع وعشرين ساعة قبل ترنسفكأيشن، يعرض للتريبسين الخلايا، عد الخلايا باستخدا?...

<ol>
	<li>Putnam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymers+for+gene+delivery+across+length+scales.">Polymers for gene delivery across length scales.</a> Nature Materials. 5, 439-451 (2006).</li><li>Sheyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+cells+in+regenerative+medicine+and+tissue+engineering.">Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7297-7301 (1995).</li><li>Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rita+Schaffer+Lecture:+Nanoparticles+for+Intracellular+Nucleic+Acid+Delivery.">Rita Schaffer Lecture: Nanoparticles for Intracellular Nucleic Acid Delivery.</a> Ann. Biomed. Eng. 40, 1408-1418 (2011).</li><li>Lynn, D. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradable+poly(beta-amino+esters):+Synthesis,+characterization,+and+self-assembly+with+plasmid+DNA.">Degradable poly(beta-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA.</a> J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).</li><li>Sunshine, J. C., Peng, D. Y., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+transfection+with+polymeric+nanoparticles+are+dependent+on+polymer+end-group+structure,+but+largely+independent+of+nanoparticle+physical+and+chemical+properties.">Uptake and transfection with polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure, but largely independent of nanoparticle physical and chemical properties.</a> Mol. Pharm. , (2012).</li><li>Shmueli, R. B., Sunshine, J. C., Xu, Z., Duh, E. J., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+nanoparticles+specific+for+human+microvasculature+and+macrovasculature.">Gene delivery nanoparticles specific for human microvasculature and macrovasculature.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. , (2012).</li><li>Bhise, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+terminal+functionalization+and+molecular+weight+of+a+gene+delivery+polymer+and+transfection+efficacy+in+mammary+epithelial+2-D+cultures+and+3-D+organotypic+cultures.">The relationship between terminal functionalization and molecular weight of a gene delivery polymer and transfection efficacy in mammary epithelial 2-D cultures and 3-D organotypic cultures.</a> Biomaterials. 31, 8088-8096 (2010).</li><li>Tzeng, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+gene+delivery+nanoparticles+based+on+poly(beta-amino+esters)+for+treatment+of+glioblastoma.">Non-viral gene delivery nanoparticles based on poly(beta-amino esters) for treatment of glioblastoma.</a> Biomaterials. 32, 5402-5410 (2011).</li><li>Sunshine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule+End-Groups+of+Linear+Polymer+Determine+Cell-Type+Gene-Delivery+Efficacy.">Small-Molecule End-Groups of Linear Polymer Determine Cell-Type Gene-Delivery Efficacy.</a> Adv. Mater. 21, 4947 (2009).</li><li>Bhise, N. S., Shmueli, R. B., Gonzalez, J., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+quantifying+the+number+of+plasmids+encapsulated+by+polymer+nanoparticles.">A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles.</a> Small. 8, 367-373 (2012).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences.">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li><li>Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+intracellular+stability+and+unpacking+of+DNA+nanocomplexes+by+quantum+dots-FRET.">Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET.</a> Journal of Controlled Release: Official journal of the Controlled Release Society. 116, 83-89 (2006).</li><li>Kreiss, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+DNA+size+does+not+affect+the+physicochemical+properties+of+lipoplexes+but+modulates+gene+transfer+efficiency.">Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency.</a> Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).</li><li>Pitard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-sized+self-assembling+lamellar+complexes+between+plasmid+DNA+and+cationic+micelles+promote+gene+transfer.">Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14412-14417 (1997).</li><li>Collins, L., Kaszuba, M., Fabre, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+solution+of+(Lys)(16)-containing+bifunctional+synthetic+peptide/DNA+nanoparticles+for+gene+delivery.">Imaging in solution of (Lys)(16)-containing bifunctional synthetic peptide/DNA nanoparticles for gene delivery.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1672, 12-20 (2004).</li><li>Green, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+polymeric+vectors+for+gene+delivery+to+human+endothelial+cells.">Biodegradable polymeric vectors for gene delivery to human endothelial cells.</a> Bioconjug. Chem. 17, 1162-1169 (2006).</li></ol>

البروتوكولات أعلاه تصف أساليب تقييم فعالية ترنسفكأيشن من الصيغ جسيمات متناهية الصغر، وكذلك وسيلة لتوصيف حجم الجسيمات والتحميل DNA من الجسيمات النانوية. عدد البلازميدات في الجسيمات هي العوامل الهامة التي يمكن أن تساعد في التنبؤ فعالية من الجسيمات ويمكن أن تستخدم أيض...

تحديد عدد البلازميدات المعقد في جسيمات متناهية الصغر من المهم أن التصميم الفعال القائم على جسيمات متناهية الصغر لتوصيل الجينات الاستراتيجيات، وخاصة للتسليم المشترك من البلازميدات متعددة إلى نفس الخلية المستهدفة، كما هو مطلوب في كثير من الأحيان الخلايا الجذعية إعادة برمجة الدراسات 12. وقد وصفت بعض النهج لحساب عدد من البلازميدات المرتبطة جسيمات متناهية الصغر واحدة، ولكل النهج عيوب في التقنيات المستخدمة لتقدير 13-16. وقد استخدم الكم نقطة (QD) جنبا إلى جنب مع وضع العلامات TEM لتقدير البلازميدات في الجسيمات في الشيتوزان القائمة على الجسيمات النانوية. معقد تقدير مع هذه التقنية QD بسبب الحاجة لتسمية DNA، والتي قد تغير في خصائص التجميع الذاتي، واحتمال أن لا يتم الكشف عن الحمض النووي غير المسماة مغلفة مباشرة؛ البلازميدات يحتمل أن تكون متداخلة وQDs في الصور TEM 2D من الجسيمات، و الافتراضات الأخرى تبسيط 13. نهج بديل هو أنpplicable عندما microdomains أمر موجود في جزيئات وقد استخدمت لدراسة الحمض النووي المجمعات Lipopolyamine عبر المجهر الإلكتروني انتقال البرد (البرد TEM)، وتشتت الأشعة السينية، وديناميكية تشتت الضوء (DLS) 14،15. للأسف، مثل المواد النانوية البوليمرية التحقيق هنا لا تنطبق مع هذا الأسلوب. وفي دراسة أخرى، وتستخدم كولينز وآخرون تدفق الجسيمات صورة تقنية التحليل لدراسة (ليز) التي تحتوي على الببتيد 16 / DNA المجمعات، إلا أنه يمكن تقييم طريقتهم فقط أكبر، ميكرون الحجم الجسيمات 16. وهكذا، فإننا وضعت مؤخرا فحص الرواية ومرنة لتحديد عدد من جسيمات متناهية الصغر في البلازميدات 11.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> كاشف </td></tr><tr><td> التخزين المؤقت المالحة الفوسفات، 1X (PBS) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 10010 </td><td></td></tr><tr><td> EGM-2MV BulletKit </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td></td></tr><tr><td> التربسين </td><td> إينفيتروجن </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> خلات الصوديوم العازلة </td><td> سيغما الدريخ </td><td> S7899 </td><td> تمييع الى 25mm في الماء منزوع الأيونات </td></tr><tr><td> ثنائي ميثيل سلفوكسيد </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 276855 </td><td></td></tr><tr><td> pEGFP DNA </td><td> المستحضرات الصيدلانية البيولوجية ايليم </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> DsRed DNA </td><td> Addgene </td><td> 21718 </td><td></td></tr><tr><td> PEI، تشعبت </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 408727 </td> &lt;TD&gt; </td></tr><tr><td> CellTiter 96 مائي واحد </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> المواد </td></tr><tr><td> مسطحة القاع واضحة بشكل جيد 96-وحة، عقيمة </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1581.001 </td><td></td></tr><tr><td> جولة القاع 96-اضحة جيدا لوحة، ومعقمة </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1582.001 </td><td></td></tr><tr><td> 12-قناة Finnpipette </td><td> الحرارية العلمية </td><td> NA </td><td> 5-50 ميكرولتر و50-300 </td></tr><tr><td> مضان المجهر </td><td> زايس </td><td> NA </td><td> موديل: AX10 </td></tr><tr><td> C6 عداد الكريات Accuri تدفق </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> HyperCyt المرفقات </td><td> Intellicyt </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> NS500</td><td> Nanosight </td><td> NA </td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of polymeric gene delivery nanoparticles by nanoparticle tracking analysis and high-throughput flow cytometry

وقد برزت غير الفيروسية توصيل الجينات باستخدام الجسيمات النانوية البوليمرية كنهج جاذبية للعلاج بالجينات لعلاج الأمراض الوراثية (1) وبوصفها تكنولوجيا للطب التجديدي 2. على عكس الفيروسات، والتي لها قضايا السلامة كبيرة، ويمكن تصميم النانوية البوليمرية أن تكون غير سامة، غير مناعة، غير مطفرة وأسهل لتجميع، وتنوعا كيميائيا، قادرة على حمل أكبر البضائع القابلة للتحلل الحمض النووي وو / أو استجابة للبيئة. البوليمرات الموجبة الشحنة السالبة مع DNA عن طريق التفاعل الكهربائي لتشكيل مجمعات بناء على أمر من 100 نانومتر التي تسمى عادة النانوية البوليمرية النفس التجمع. أمثلة على المواد الحيوية المستخدمة لتشكيل البنى النانوية لتوصيل الجينات polycationic تشمل متعدد الليزين، polyphosphoesters، وبولي (amidoamines) ق وpolyethylenimine (PEI)، وهو غير القابلة للتحلل قبالة الجاهزة للاستخدام البوليمر الموجبة تستخدم عادة لتسليم الحمض النووي 1،3. بولي (بيتا الأمينيةاستر) ق (PBAEs) هي أحدث فئة من البوليمرات الموجبة 4 أن للتفكك وهيدروليكيا 5،6 وقد ثبت أن تكون فعالة في إيصال الجينات إلى أنواع الخلايا التي يصعب بالنقل مثل خلايا الشبكية البطانية الإنسان (HRECs) 7، الماوس الخلايا الظهارية الثديية 8، خلايا سرطان الدماغ 9 و الأوعية الكبيرة (الإنسان الوريد السري، HUVECs) الخلايا البطانية 10. ووصف بروتوكول جديد لتوصيف جزيئات البوليمر باستخدام تحليل جسيمات متناهية الصغر تتبع (NTA). في هذا النهج، ويتم الحصول على كل حجم الجسيمات توزيع وتوزيع عدد من الجسيمات في البلازميدات 11. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تقديم الإنتاجية العالية ترنسفكأيشن 96-وحة جيدا الفحص للكشف السريع للفعالية ترنسفكأيشن من الجسيمات النانوية البوليمرية. وتستخدم في هذا البروتوكول، وتستخدم بولي (بيتا الأمينية استر) ق (PBAEs) والبوليمرات ونموذج الإنسان الخلايا البطانية الشبكية (HRECs) كما موديل الخلايا البشرية. يمكن هذا البروتوكول تكيف بسهولة مع أي جسيمات متناهية الصغر البوليمرية تقييم وأي نوع من الخلايا في المصالح في شكل لوحة متعددة أيضا.

ويظهر الشكل 1 صورة من مضان المجهري مثال على نجاح HRECs ترنسفكأيشن مع البلازميد EGFP. الصورة brightfield مفيد لضمان الحفاظ على التشكل أن الخلايا المعتادة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام المقايسات بقاء الخلية، مثل MTS أو المقايسات مماثلة، لتقييم سمية جسيمات متناهية الصغ...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry at JoVE.com

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

يوصف بروتوكول للتحليل تتبع جسيمات متناهية الصغر (NTA) والإنتاجية العالية التدفق الخلوي لتقييم البوليمرية النانوية لتوصيل الجينات. ويستخدم لوصف NTA حجم الجسيمات جسيمات متناهية الصغر وتوزيع البلازميد توزيع الجسيمات في. الإنتاجية العالية التدفق الخلوي تمكن الكمي تقييم فعالية ترنسفكأيشن للمكتبة من المواد الحيوية لتوصيل الجينات.

تقييم توصيل الجينات البوليمرية الجسيمات النانوية من تحليل تتبع جسيمات متناهية الصغر وعالية الإنتاجية قياس التدفق الخلوي

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

صياغة النانوية Diblock البوليمر من خلال تقنيات Nanoprecipitation

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

[ميكروأرس] البوليمر لاكتشاف إنتاجية عالية من المواد الحيوية

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

اندماجي تجميع وعالية الإنتاجية الإصدار البروتين من فيلم البوليمر ومكتبات جسيمات متناهية الصغر

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

تحليل التطبع الخلوي من الجزيئات الدقيقة والبكتيريا التي متعددة الأطياف التصوير التدفق الخلوي

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

الإنتاجية العالية لتخليق الكربوهيدرات وFunctionalization النانوية Polyanhydride

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

البوليمر تصنيع صفيف إبرة مجهرية من قبل الطباعة التصويرية

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

تطبيقات تصنيع وتسليم المخدرات من النانوية الحرير

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

عزل الخلايا العقدة الشبكية الفئران الأولية (رغس) عن طريق التدفق الخلوي

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

نظام ميكروبيوريكتور لإنتاج IgG1 النموذجي في الخلايا شو الآلي استخدام الفائق

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

فلاش نانوبريسيبيتيشن لتغليف مركبات مسعور وماء في الجسيمات النانوية البوليمرية

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...