Name: evaluation of polymeric gene delivery nanoparticles by nanoparticle tracking analysis and high-throughput flow cytometry
Uploaded: 2013-03-01T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry at JoVE.com

De auteurs danken de TEDCO MSCRF (2009-MSCRFE-0098-00) en NIH R21CA152473 voor ondersteuning.

1. Cel Zaaien <ol><li> Sta niet toe dat cellen om te groeien naar overconfluency. Gebruik vroege passage cellen als transfecteren primaire cellen. </li><li> Vierentwintig uur voor transfectie, trypsinize de cellen telt de cellen met een hemocytometer en verdunnen celsuspensie met media op de gewenste celdichtheid (cellen / volume) te bereiken. Zaad cellen in weefselkweek heldere behandelde vlakke bodem 96-well platen met een reservoir en multichannel pipetten. De gekozen dichtheid moet geven 70-80% confluentie op de d...

<ol>
	<li>Putnam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymers+for+gene+delivery+across+length+scales.">Polymers for gene delivery across length scales.</a> Nature Materials. 5, 439-451 (2006).</li><li>Sheyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+cells+in+regenerative+medicine+and+tissue+engineering.">Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7297-7301 (1995).</li><li>Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rita+Schaffer+Lecture:+Nanoparticles+for+Intracellular+Nucleic+Acid+Delivery.">Rita Schaffer Lecture: Nanoparticles for Intracellular Nucleic Acid Delivery.</a> Ann. Biomed. Eng. 40, 1408-1418 (2011).</li><li>Lynn, D. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradable+poly(beta-amino+esters):+Synthesis,+characterization,+and+self-assembly+with+plasmid+DNA.">Degradable poly(beta-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA.</a> J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).</li><li>Sunshine, J. C., Peng, D. Y., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+transfection+with+polymeric+nanoparticles+are+dependent+on+polymer+end-group+structure,+but+largely+independent+of+nanoparticle+physical+and+chemical+properties.">Uptake and transfection with polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure, but largely independent of nanoparticle physical and chemical properties.</a> Mol. Pharm. , (2012).</li><li>Shmueli, R. B., Sunshine, J. C., Xu, Z., Duh, E. J., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+nanoparticles+specific+for+human+microvasculature+and+macrovasculature.">Gene delivery nanoparticles specific for human microvasculature and macrovasculature.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. , (2012).</li><li>Bhise, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+terminal+functionalization+and+molecular+weight+of+a+gene+delivery+polymer+and+transfection+efficacy+in+mammary+epithelial+2-D+cultures+and+3-D+organotypic+cultures.">The relationship between terminal functionalization and molecular weight of a gene delivery polymer and transfection efficacy in mammary epithelial 2-D cultures and 3-D organotypic cultures.</a> Biomaterials. 31, 8088-8096 (2010).</li><li>Tzeng, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+gene+delivery+nanoparticles+based+on+poly(beta-amino+esters)+for+treatment+of+glioblastoma.">Non-viral gene delivery nanoparticles based on poly(beta-amino esters) for treatment of glioblastoma.</a> Biomaterials. 32, 5402-5410 (2011).</li><li>Sunshine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule+End-Groups+of+Linear+Polymer+Determine+Cell-Type+Gene-Delivery+Efficacy.">Small-Molecule End-Groups of Linear Polymer Determine Cell-Type Gene-Delivery Efficacy.</a> Adv. Mater. 21, 4947 (2009).</li><li>Bhise, N. S., Shmueli, R. B., Gonzalez, J., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+quantifying+the+number+of+plasmids+encapsulated+by+polymer+nanoparticles.">A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles.</a> Small. 8, 367-373 (2012).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences.">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li><li>Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+intracellular+stability+and+unpacking+of+DNA+nanocomplexes+by+quantum+dots-FRET.">Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET.</a> Journal of Controlled Release: Official journal of the Controlled Release Society. 116, 83-89 (2006).</li><li>Kreiss, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+DNA+size+does+not+affect+the+physicochemical+properties+of+lipoplexes+but+modulates+gene+transfer+efficiency.">Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency.</a> Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).</li><li>Pitard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-sized+self-assembling+lamellar+complexes+between+plasmid+DNA+and+cationic+micelles+promote+gene+transfer.">Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14412-14417 (1997).</li><li>Collins, L., Kaszuba, M., Fabre, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+solution+of+(Lys)(16)-containing+bifunctional+synthetic+peptide/DNA+nanoparticles+for+gene+delivery.">Imaging in solution of (Lys)(16)-containing bifunctional synthetic peptide/DNA nanoparticles for gene delivery.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1672, 12-20 (2004).</li><li>Green, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+polymeric+vectors+for+gene+delivery+to+human+endothelial+cells.">Biodegradable polymeric vectors for gene delivery to human endothelial cells.</a> Bioconjug. Chem. 17, 1162-1169 (2006).</li></ol>

De protocollen hierboven beschreven methoden voor de transfectie efficiëntie van nanodeeltjes formuleringen, alsmede een manier om de deeltjesgrootte en DNA laden van de nanodeeltjes te karakteriseren. Het aantal plasmiden per deeltje is een belangrijke parameter die kan helpen bij het voorspellen van de effectiviteit van het deeltje en kan ook worden gebruikt voor dosisbepaling. Nanodeeltjes tracking analyse kan worden uitgevoerd in een aantal verschillende waterige oplossingen, zoals verschillen in zoutconcentratie. ...

De bepaling van het aantal plasmiden gecomplexeerd per nanodeeltjes belangrijk te ontwerpen effectieve nanodeeltjes gebaseerde gentherapie strategieën, vooral voor co-levering van meerdere plasmiden in dezelfde cel doel, zoals vaak vereist in stamcellen herprogrammering studies 12. Verschillende manieren om het aantal plasmiden geassocieerd met een nanodeeltje bepalen zijn beschreven, en elke benadering heeft nadelen in de technieken voor schatting 13-16. Quantum dot (QD) labeling gecombineerd met TEM wordt gebruikt om plasmiden per deeltje schatten chitosan gebaseerde nanopartikels. Deze schatting QD techniek gecompliceerd door de noodzaak om de DNA dat daarvan kunnen veranderen zelfassemblage labelen, de mogelijkheid dat ingekapselde ongelabelde DNA niet direct gedetecteerd; mogelijke overlap plasmiden en QDs in de 2D TEM beelden van deeltjes en andere vereenvoudigende veronderstellingen 13. Een alternatieve benadering is dat eenpplicable besteld microdomeinen aanwezig in de deeltjes is gebruikt om Lipopolyamine-DNA complexen via cryo-transmissie-elektronenmicroscopie (cryo-TEM), X-ray scattering en dynamische lichtverstrooiing (DLS) 14,15 bestuderen. Helaas materialen zoals de polymere nanodeeltjes hier onderzochte niet van toepassing bij deze methode. . In een andere studie, Collins et al gebruikt een stroom deeltjes beeldanalysetechniek bestuderen (Lys) 16 bevattend peptide / DNA complexen, maar de methode kan alleen beoordelen grotere micron-deeltjes 16. Zo hebben we onlangs een nieuwe en flexibele bepaling van het aantal plasmiden nanodeeltjes 11 kwantificeren.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Fosfaat gebufferde zoutoplossing, 1x (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 10010 </td><td></td></tr><tr><td> EGM-2mV BulletKit </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine </td><td> Invitrogen </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumacetaatbuffer </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7899 </td><td> Verdun tot 25 mM in gedeïoniseerd water </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 276855 </td><td></td></tr><tr><td> pEGFP DNA </td><td> Elim Biopharmaceuticals </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> DsRed DNA </td><td> Addgene </td><td> 21718 </td><td></td></tr><tr><td> PEI, vertakte </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 408727 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> CellTiter 96 Waterige Een </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Materieel </td></tr><tr><td> Duidelijke platte bodem 96-well plaat, steriele </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1581.001 </td><td></td></tr><tr><td> Foutloos bodem 96-well plaat, steriele </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1582.001 </td><td></td></tr><tr><td> 12-kanaals Finnpipette </td><td> Thermo Scientific </td><td> NA </td><td> 5 tot 50 en 50 tot 300 ul </td></tr><tr><td> Fluorescentiemicroscoop </td><td> Zeiss </td><td> NA </td><td> Model nummer: AX10 </td></tr><tr><td> C6 Accuri flowcytometer </td><td> BD Biosciences </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> HyperCyt bevestiging </td><td> Intellicyt </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> NS500</td><td> NanoSight </td><td> NA </td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of polymeric gene delivery nanoparticles by nanoparticle tracking analysis and high-throughput flow cytometry

Niet-virale gen-levering met gebruik van polymere nanodeeltjes heeft zich ontpopt als een aantrekkelijke aanpak voor gentherapie voor de behandeling van genetische ziekten 1 en als een technologie voor regeneratieve geneeskunde 2. In tegenstelling tot virussen die aanzienlijke veiligheidsproblemen hebben, kunnen polymère nanodeeltjes worden ontworpen als zijnde niet-toxisch, niet-immunogeen, niet-mutageen, gemakkelijker te synthetiseren, chemisch veelzijdig, die in staat groter nucleïnezuur lading en biologisch afbreekbare en / of ecologisch reageren. Kationische polymeren zelf-assembleren met negatief geladen DNA via elektrostatische interactie complexen in de orde van 100 nm die vaak worden genoemd polymère nanodeeltjes vormen. Voorbeelden van biomaterialen gebruikt nanoschaal polykationische genafgifte nanodeeltjes vormen omvatten polylysine, polyphosphoesters, poly (amidoamines) s en polyethyleenimine (PEI), een niet-afbreekbare off-the-shelf kationische polymeer gebruikt voor nucleïnezuurafleverende 1,3. Poly (beta-aminoester) s (PBAEs) zijn een nieuwe klasse van kationische polymeren die hydrolytisch 4 afbreekbaar 5,6 en zijn effectief gebleken bij genoverdracht naar moeilijk te transfecteren celtypes zoals humane endotheelcellen retinale (HRECs) 7, muizen mammaire epitheelcellen 8, menselijk hersenkankercellen 9 en macrovasculaire (humane navelstreng, HUVECs) endotheelcellen 10. Een nieuw protocol bij polymere nanodeeltjes gebruik te maken van nanodeeltjes tracking analyse (NTA) te karakteriseren wordt beschreven. In deze benadering worden zowel de deeltjesgrootteverdeling en de verdeling van het aantal plasmiden per deeltje verkregen 11. Daarnaast wordt een high-throughput 96-well plaat transfectie assay voor snelle screening van de transfectie efficiëntie van polymeer nanodeeltjes gepresenteerd. In dit protocol, poly (beta-amino ester) s (PBAEs) worden gebruikt als model polymeren en menselijke retinale endotheelcellen (HRECs) worden gebruikt als model menselijke cellen. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan elk polymeer nanodeeltjes en elk celtype plaats in een multi-well plaat formaat evalueren.

Figuur 1 een fluorescentiemicroscopie beeld van een voorbeeld van een succesvolle transfectie van HRECs de EGFP plasmide. De helder veldbeeld is nuttig om te waarborgen dat cellen hun normale morfologie te behouden. Bovendien kan cellevensvatbaarheidsassays, zoals MTS of vergelijkbare testen worden gebruikt om de toxiciteit nanodeeltjes 7 beoordelen. Flowcytometrie, zoals beschreven, kan worden gebruikt om de transfectie-efficiëntie te kwantificeren. Bij gebruik van de HyperCyt multi-well pl...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry at JoVE.com

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Een protocol voor de nanodeeltjes tracking analyse (NTA) en high-throughput flowcytometrie om polymere genafgifte nanodeeltjes evalueren beschreven. NTA wordt gebruikt om de nanodeeltjes deeltjesgrootteverdeling en het plasmide per deeltjesverdeling karakteriseren. High-throughput flowcytometrie in staat stelt kwantitatieve transfectie efficiëntie evaluatie voor een bibliotheek van gen delivery biomaterialen.

Evaluatie van polymere Gene Delivery Nanodeeltjes door Nanodeeltje Tracking Analyse en High-throughput Flow cytometrie

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Formulering van diblok polymere nanodeeltjes door middel van Nanoprecipitation Techniek

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Polymeer Microarrays voor High Throughput Ontdekking van biomaterialen

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Combinatoriële Synthese van en high-throughput eiwit Op de markt van Polymer Film en Nanodeeltje bibliotheken

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Het analyseren van cellulaire internalisatie van nanodeeltjes en bacteriën door Multi-spectrale Imaging flowcytometrie

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

High-throughput synthese van koolhydraten en functionalisering van polyanhydride Nanodeeltjes

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

Polymere Microneedle Array Fabrication door Fotolithografie

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Fabricage en Drug Delivery Toepassingen van Silk Nanodeeltjes

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Isolatie van Primaire Murine Retinale Ganglioncellen (RGC&#39;s) door Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Gebruik van High-Throughput geautomatiseerd Microbioreactor-systeem voor de productie van Model IgG1 in CHO cellen

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

NanoPrecipitation Flash voor de inkapseling van hydrofobe en hydrofiele stoffen in polymere nanodeeltjes

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...