Name: evaluation of polymeric gene delivery nanoparticles by nanoparticle tracking analysis and high-throughput flow cytometry
Uploaded: 2013-03-01T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry at JoVE.com

Les auteurs remercient le MSCRF TEDCO (2009-MSCRFE-0098-00) et le NIH R21CA152473 de soutien.

1. L&#39;ensemencement de cellules <ol><li> Ne pas permettre aux cellules de se développer à overconfluency. Utilisez le passage des cellules au début quand la transfection de cellules primaires. </li><li> Vingt-quatre heures avant la transfection, les cellules trypsiniser, compter le nombre de cellules à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre, et diluer la suspension cellulaire avec les médias pour atteindre la densité cellulaire désirée (cellules / volume). Cellules de semences dans les tissus clairs culture tr...

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	<li>Putnam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymers+for+gene+delivery+across+length+scales.">Polymers for gene delivery across length scales.</a> Nature Materials. 5, 439-451 (2006).</li><li>Sheyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+cells+in+regenerative+medicine+and+tissue+engineering.">Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proc. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+transfection+with+polymeric+nanoparticles+are+dependent+on+polymer+end-group+structure,+but+largely+independent+of+nanoparticle+physical+and+chemical+properties.">Uptake and transfection with polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure, but largely independent of nanoparticle physical and chemical properties.</a> Mol. Pharm. , (2012).</li><li>Shmueli, R. B., Sunshine, J. C., Xu, Z., Duh, E. J., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+nanoparticles+specific+for+human+microvasculature+and+macrovasculature.">Gene delivery nanoparticles specific for human microvasculature and macrovasculature.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. , (2012).</li><li>Bhise, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+terminal+functionalization+and+molecular+weight+of+a+gene+delivery+polymer+and+transfection+efficacy+in+mammary+epithelial+2-D+cultures+and+3-D+organotypic+cultures.">The relationship between terminal functionalization and molecular weight of a gene delivery polymer and transfection efficacy in mammary epithelial 2-D cultures and 3-D organotypic cultures.</a> Biomaterials. 31, 8088-8096 (2010).</li><li>Tzeng, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+gene+delivery+nanoparticles+based+on+poly(beta-amino+esters)+for+treatment+of+glioblastoma.">Non-viral gene delivery nanoparticles based on poly(beta-amino esters) for treatment of glioblastoma.</a> Biomaterials. 32, 5402-5410 (2011).</li><li>Sunshine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule+End-Groups+of+Linear+Polymer+Determine+Cell-Type+Gene-Delivery+Efficacy.">Small-Molecule End-Groups of Linear Polymer Determine Cell-Type Gene-Delivery Efficacy.</a> Adv. Mater. 21, 4947 (2009).</li><li>Bhise, N. S., Shmueli, R. B., Gonzalez, J., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+quantifying+the+number+of+plasmids+encapsulated+by+polymer+nanoparticles.">A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles.</a> Small. 8, 367-373 (2012).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences.">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li><li>Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+intracellular+stability+and+unpacking+of+DNA+nanocomplexes+by+quantum+dots-FRET.">Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET.</a> Journal of Controlled Release: Official journal of the Controlled Release Society. 116, 83-89 (2006).</li><li>Kreiss, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+DNA+size+does+not+affect+the+physicochemical+properties+of+lipoplexes+but+modulates+gene+transfer+efficiency.">Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency.</a> Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).</li><li>Pitard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-sized+self-assembling+lamellar+complexes+between+plasmid+DNA+and+cationic+micelles+promote+gene+transfer.">Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer.</a> Proc. 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Les protocoles ci-dessus décrivent des méthodes pour évaluer l&#39;efficacité de transfection des formulations de nanoparticules, ainsi que d&#39;un moyen pour caractériser la taille des particules et de la charge des nanoparticules d&#39;ADN. Le nombre de plasmides par des particules est un paramètre important qui peut aider à prédire l&#39;efficacité de la particule et peut également être utilisé pour la détermination de la dose. Analyse de suivi de nanoparticules peut être effectuée dans une gamme de d...

La détermination du nombre de plasmides complexés par nanoparticule est important de concevoir des nanoparticules efficaces des stratégies de transfert de gènes, en particulier pour la co-délivrance de plasmides multiples à la même cellule cible, comme il est souvent nécessaire dans les cellules souches reprogrammation des études 12. Quelques approches pour calculer le nombre de plasmides associés à une nanoparticule unique ont été décrites, et chaque approche présente des inconvénients dans les techniques utilisées pour l&#39;estimation de 13-16. Quantum dot (QD) combiné avec l&#39;étiquetage TEM a été utilisée pour estimer les plasmides par des particules de chitosane à base de nanoparticules. Estimation avec cette technique QD est compliquée en raison de la nécessité pour marquer l&#39;ADN, ce qui peut altérer ses propriétés d&#39;auto-assemblage, la possibilité que l&#39;ADN encapsulé sans étiquette n&#39;est pas directement détectée; plasmides potentiellement se chevauchent et QDS dans les images TEM 2D de particules, et d&#39;autres hypothèses simplificatrices 13. Une autre approche qui est unepplicable quand microdomaines ordonnés existent dans les particules a été utilisée pour étudier Lipopolyamine-ADN par cryo-microscopie électronique à transmission (cryo-MET), diffraction des rayons X et diffusion de lumière dynamique (DLS) 14,15. Malheureusement, les matériaux tels que les nanoparticules polymériques étudiés ici ne sont pas applicables à cette méthode. . Dans une autre étude, Collins et al ont utilisé une particule flux de l&#39;analyse d&#39;image technique pour étudier (Lys) 16-peptidiques contenant / ADN, mais leur méthode ne peut évaluer plus, particules microniques 16. Ainsi, nous avons récemment mis au point un nouveau test et flexible afin de quantifier le nombre de plasmides par nanoparticule 11.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Réactif </td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline, 1x (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 10010 </td><td></td></tr><tr><td> EGM-2MV BulletKit </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine </td><td> Invitrogen </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> Un tampon d&#39;acétate de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7899 </td><td> Diluer à 25 mM dans de l&#39;eau désionisée </td></tr><tr><td> Le diméthylsulfoxyde </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 276855 </td><td></td></tr><tr><td> pEGFP ADN </td><td> Biopharmaceuticals Elim </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> ADN DsRed </td><td> Addgene </td><td> 21718 </td><td></td></tr><tr><td> Prince-Édouard, ramifié </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 408727 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> CellTiter 96 aqueuse une </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Matériels </td></tr><tr><td> Effacer fond plat de 96 puits, stérile </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1581.001 </td><td></td></tr><tr><td> Effacer fond rond de 96 puits, stérile </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1582.001 </td><td></td></tr><tr><td> 12-canaux Finnpipette </td><td> Thermo Scientific </td><td> NA </td><td> 5-50 et 50-300 ul </td></tr><tr><td> Microscope à fluorescence </td><td> Zeiss </td><td> NA </td><td> Numéro de modèle: AX10 </td></tr><tr><td> Cytomètre en flux C6 Accuri </td><td> BD Biosciences </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> Attachement HyperCyt </td><td> Intellicyt </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> NS500</td><td> NanoSight </td><td> NA </td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of polymeric gene delivery nanoparticles by nanoparticle tracking analysis and high-throughput flow cytometry

Transfert de gènes non viral en utilisant des nanoparticules polymériques est apparue comme une approche intéressante pour la thérapie génique pour traiter les maladies génétiques 1 et comme une technologie pour la médecine régénérative 2. Contrairement aux virus, qui ont des problèmes de sécurité importants, des nanoparticules polymériques peuvent être conçus pour être non-toxique, non-immunogène, non mutagène, plus faciles à synthétiser chimiquement polyvalent, capable de transporter plus de fret acide nucléique et biodégradable et / ou soucieux de l&#39;environnement. Polymères cationiques s&#39;auto-assembler à l&#39;ADN chargé négativement par l&#39;intermédiaire d&#39;une interaction électrostatique pour former des complexes de l&#39;ordre de 100 nm qui sont communément appelées nanoparticules polymériques. Des exemples de biomatériaux utilisés pour former l&#39;échelle nanométrique des nanoparticules polycationiques de transfert de gènes comprennent la polylysine, polyphosphoesters, le poly (amidoamines) s et polyéthylènimine (PEI), ce qui est un non-dégradable off-the-shelf polymère cationique couramment utilisé pour la délivrance d&#39;acides nucléiques 1,3. Poly (bêta-aminoester) s (PBAEs) sont une nouvelle classe de polymères cationiques 4 qui sont hydrolytiquement dégradable et 5,6 ont été montré pour être efficace au transfert de gènes à des types cellulaires difficiles à transfecter comme les cellules endothéliales rétiniennes humaines (HREC) 7, les cellules épithéliales mammaires de souris 8, les cellules humaines de cancer du cerveau 9 et macrovasculaires (veine ombilicale humaine, HUVEC) des cellules endothéliales 10. Un nouveau protocole pour caractériser des nanoparticules polymériques en utilisant des nanoparticules d&#39;analyse de suivi (NTA) est décrite. Dans cette approche, tous les deux la distribution granulométrique et la distribution du nombre de particules par les plasmides sont obtenus 11. En outre, un haut débit de dosage de 96 puits de transfection plaque pour le dépistage rapide de l&#39;efficacité de transfection des nanoparticules polymériques est présenté. Dans ce protocole, le poly (bêta-amino ester) s (PBAEs) sont utilisés en tant que polymères de l&#39;homme et des modèles de cellules endothéliales rétiniennes (HREC) sont utilisés comme mocellules del humains. Ce protocole peut être facilement adapté pour évaluer une nanoparticule polymère et n&#39;importe quel type cellulaire d&#39;intérêt dans un format de plaque multi-puits.

La figure 1 montre une image de microscopie à fluorescence d&#39;un exemple d&#39;une transfection réussie de HREC avec le plasmide EGFP. L&#39;image en fond clair est utile de s&#39;assurer que les cellules conservent leur morphologie habituelle. En outre, les tests de viabilité cellulaire, tels que MTS ou des tests similaires, peuvent être utilisés pour évaluer la toxicité des nanoparticules 7. La cytométrie en flux, tel que décrit, peut être utilisé pour quantifier l&#39;efficac...

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Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Un protocole d&#39;analyse de suivi de nanoparticules (NTA) et cytométrie de flux à haut débit afin d&#39;évaluer polymères nanoparticules de transfert de gènes est décrite. NTA est utilisé pour caractériser la distribution des tailles de particules des nanoparticules et la distribution de particules de plasmide par. Cytométrie en flux à haut débit permet l&#39;évaluation quantitative efficacité de transfection pour une bibliothèque de biomatériaux de transfert de gènes.

Évaluation de livraison Gene polymère nanoparticules d&#39;analyse de suivi par des nanoparticules et de cytométrie en flux à haut débit

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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