Name: evaluation of polymeric gene delivery nanoparticles by nanoparticle tracking analysis and high-throughput flow cytometry
Uploaded: 2013-03-01T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry at JoVE.com

המחברים מודים TEDCO MSCRF (2009-MSCRFE-0098-00) וNIH R21CA152473 לקבלת תמיכה.

1. זריעת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תאפשרו לתאים לגדול ל overconfluency. השתמש בתאי מעבר מוקדמים כאשר transfecting תאים ראשוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עשרים וארבע שעות לפני transfection, trypsinize התאים, ספירת התאים באמצעות hemocytometer, ולדלל את השעית התא עם ?...

<ol>
	<li>Putnam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymers+for+gene+delivery+across+length+scales.">Polymers for gene delivery across length scales.</a> Nature Materials. 5, 439-451 (2006).</li><li>Sheyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+cells+in+regenerative+medicine+and+tissue+engineering.">Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7297-7301 (1995).</li><li>Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rita+Schaffer+Lecture:+Nanoparticles+for+Intracellular+Nucleic+Acid+Delivery.">Rita Schaffer Lecture: Nanoparticles for Intracellular Nucleic Acid Delivery.</a> Ann. Biomed. Eng. 40, 1408-1418 (2011).</li><li>Lynn, D. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradable+poly(beta-amino+esters):+Synthesis,+characterization,+and+self-assembly+with+plasmid+DNA.">Degradable poly(beta-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA.</a> J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).</li><li>Sunshine, J. C., Peng, D. Y., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+transfection+with+polymeric+nanoparticles+are+dependent+on+polymer+end-group+structure,+but+largely+independent+of+nanoparticle+physical+and+chemical+properties.">Uptake and transfection with polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure, but largely independent of nanoparticle physical and chemical properties.</a> Mol. Pharm. , (2012).</li><li>Shmueli, R. B., Sunshine, J. C., Xu, Z., Duh, E. J., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+nanoparticles+specific+for+human+microvasculature+and+macrovasculature.">Gene delivery nanoparticles specific for human microvasculature and macrovasculature.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. , (2012).</li><li>Bhise, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+terminal+functionalization+and+molecular+weight+of+a+gene+delivery+polymer+and+transfection+efficacy+in+mammary+epithelial+2-D+cultures+and+3-D+organotypic+cultures.">The relationship between terminal functionalization and molecular weight of a gene delivery polymer and transfection efficacy in mammary epithelial 2-D cultures and 3-D organotypic cultures.</a> Biomaterials. 31, 8088-8096 (2010).</li><li>Tzeng, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+gene+delivery+nanoparticles+based+on+poly(beta-amino+esters)+for+treatment+of+glioblastoma.">Non-viral gene delivery nanoparticles based on poly(beta-amino esters) for treatment of glioblastoma.</a> Biomaterials. 32, 5402-5410 (2011).</li><li>Sunshine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule+End-Groups+of+Linear+Polymer+Determine+Cell-Type+Gene-Delivery+Efficacy.">Small-Molecule End-Groups of Linear Polymer Determine Cell-Type Gene-Delivery Efficacy.</a> Adv. Mater. 21, 4947 (2009).</li><li>Bhise, N. S., Shmueli, R. B., Gonzalez, J., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+quantifying+the+number+of+plasmids+encapsulated+by+polymer+nanoparticles.">A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles.</a> Small. 8, 367-373 (2012).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences.">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li><li>Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+intracellular+stability+and+unpacking+of+DNA+nanocomplexes+by+quantum+dots-FRET.">Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET.</a> Journal of Controlled Release: Official journal of the Controlled Release Society. 116, 83-89 (2006).</li><li>Kreiss, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+DNA+size+does+not+affect+the+physicochemical+properties+of+lipoplexes+but+modulates+gene+transfer+efficiency.">Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency.</a> Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).</li><li>Pitard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-sized+self-assembling+lamellar+complexes+between+plasmid+DNA+and+cationic+micelles+promote+gene+transfer.">Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14412-14417 (1997).</li><li>Collins, L., Kaszuba, M., Fabre, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+solution+of+(Lys)(16)-containing+bifunctional+synthetic+peptide/DNA+nanoparticles+for+gene+delivery.">Imaging in solution of (Lys)(16)-containing bifunctional synthetic peptide/DNA nanoparticles for gene delivery.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1672, 12-20 (2004).</li><li>Green, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+polymeric+vectors+for+gene+delivery+to+human+endothelial+cells.">Biodegradable polymeric vectors for gene delivery to human endothelial cells.</a> Bioconjug. Chem. 17, 1162-1169 (2006).</li></ol>

הפרוטוקולים הנ&quot;ל מתארים שיטות להערכת יעילות transfection של ניסוחי nanoparticle, כמו גם דרך לאפיון גודל החלקיקים וטעינת ה-DNA של החלקיקים. מספר פלסמידים לחלקיק הוא פרמטר חשוב שיכול לעזור לנבא את היעילות של החלקיקים ויכול לשמש גם לקביעת מינון. Nanoparticle מעקב וניתוח יכול להתבצע במג?...

קביעת מספר פלסמידים והמורכבים לnanoparticle חשובה לתכנן אסטרטגיות יעילות nanoparticle מבוססות גני מסירה, במיוחד לשיתוף מסירה של פלסמידים מרובים לאותו יעד תא, לעתים קרובות יש צורך בתכנות מחדש של תאי גזע מחקרים 12. גישות אחדות כדי לחשב את מספר פלסמידים הקשורים nanoparticle אחת כבר תאר, וכל גישה יש חסרונות בטכניקות המשמשות להערכה 13-16. תיוג נקודה קוונטית (QD) בשילוב עם TEM נעשה שימוש כדי לאמוד פלסמידים לחלקיקי חלקיקי chitosan מבוססים. הערכה עם טכניקת QD זה היא מסובך בשל הצורך לתייג את ה-DNA, שעשוי לשנות את תכונותיו הרכבה עצמית: האפשרות שהדנ&quot;א ללא תווית הכמוס הוא אינו מזוהה באופן ישיר; פלסמידים וQDs בתמונות TEM 2D של חלקיקי פוטנציאל חופפים; ו הנחות מפשטות אחרות 13. גישה חלופית שהיאpplicable כאשר microdomains הורה קיים בחלקיקים נעשה שימוש כדי ללמוד מתחמי Lipopolyamine-DNA באמצעות מיקרוסקופיה קריו-אלקטרון הולכה (cryo-TEM), פיזור קרן ה-X, ופיזור אור דינמי (DLS) 14,15. למרבה הצער, חומרים כגון החלקיקים פולימריים נחקרו כאן אינם ישימים בשיטה זו. . במחקר אחר, קולינס ואח&#39; השתמש בטכניקת זרימת חלקיקי תמונת ניתוח ללמוד (יס) 16 מתחמים המכיל פפטיד / דנ&quot;א, אולם השיטה שלהם יכולה רק להעריך חלקיקים גדולים יותר, בגודל 16 מיקרון. לפיכך, לאחרונה פותח בדיקה חדשה וגמישה כדי לכמת את מספר פלסמידים לnanoparticle 11.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> מגיב </td></tr><tr><td> נאגר מלוח פוספט, 1x (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 10010 </td><td></td></tr><tr><td> BulletKit EGM-2MV </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td></td></tr><tr><td> טריפסין </td><td> Invitrogen </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> חיץ נתרן יצטט </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> S7899 </td><td> לדלל במים ל25mm deionized </td></tr><tr><td> sulfoxide דימתיל </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 276855 </td><td></td></tr><tr><td> pEGFP DNA </td><td> Biopharmaceuticals האילם </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> דנ&quot;א DsRed </td><td> Addgene </td><td> 21718 </td><td></td></tr><tr><td> PEI, הסתעף </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 408727 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> 96 מימיים CellTiter אחד </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> חומרים </td></tr><tr><td> דירה תחתונה ברור צלחת 96-כן, סטרילי </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1581.001 </td><td></td></tr><tr><td> תחתון ברור סביב צלחת 96-היטב, סטרילי </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1582.001 </td><td></td></tr><tr><td> ערוץ 12-Finnpipette </td><td> Thermo Scientific </td><td> NA </td><td> 5-50 ו50-300 μl </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ פלואורסצנטי </td><td> Zeiss </td><td> NA </td><td> מספר דגם: AX10 </td></tr><tr><td> cytometer הזרימה Accuri C6 </td><td> BD Biosciences </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> קובץ מצורף HyperCyt </td><td> Intellicyt </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> NS500</td><td> NanoSight </td><td> NA </td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of polymeric gene delivery nanoparticles by nanoparticle tracking analysis and high-throughput flow cytometry

מסירת גן ללא ויראלי באמצעות חלקיקים פולימריים התפתחה כגישה אטרקטיבית לריפוי גנטי לטיפול במחלות גנטיות 1 וכטכנולוגיה לרפואת רגנרטיבית 2. בניגוד לוירוסים, אשר יש להם בעיות בטיחות משמעותיות, חלקיקים פולימריים ניתן תוכנן להיות רעיל, אינו immunogenic, הלא מוטגניות, קל לסנתז, כימי תכליתי, מסוגל לשאת מטען גדול יותר חומצות גרעין ומתכלה ו / או לסביבה מגיב. פולימרי קטיוני עצמי להרכיב עם DNA הטעון שלילי באמצעות אינטראקציה אלקטרוסטטית ליצירת קומפלקסים על בסדר הגודל של 100 ננומטר, מכונות חלקיקים פולימריים נפוצים. דוגמאות לחומרים ביולוגיים המשמשים ליצירת חלקיקים ננומטריים משלוח polycationic גן כוללות, polyphosphoesters polylysine, פולי (amidoamines) של וpolyethylenimine (PEI), שהוא מהמדף את שאינם מתכלה, פולימר קטיוני הנפוץ למסירת חומצות גרעין 1,3. פולי (בטא אמיניתאסתר) של (PBAEs) הוא סוג חדש יותר של פולימרי 4 קטיוני שhydrolytically מתכלה 5,6 והוכחו כיעילים במשלוח גן לסוגי תאים קשים לtransfect כגון תאים אנושיים רשתית האנדותל (HRECs) 7, תאי עכבר חלב אפיתל 8, תאי אדם סרטני במוח 9 ו macrovascular (וריד טבור אנושי, HUVECs) תאי אנדותל 10. פרוטוקול חדש לאפיון חלקיקים פולימריים ניצול Nanoparticle מעקב וניתוח (נ.ת. ע) מתואר. בגישה זו, היא התפלגות גודל החלקיקים וההפצה של מספר פלסמידים לחלקיק מתקבלות 11. בנוסף, בדיקת תפוקה גבוהה 96 היטב צלחת transfection לסינון מהיר של יעילות transfection של חלקיקים פולימריים מוצגת. בפרוטוקול זה, (אסתר בטא אמינו) של פולי (PBAEs) משמשים כמודל פולימרים ותאי האנדותל רשתית אנושיים (HRECs) משמש כמותאים אנושיים דלים. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות להעריך כל nanoparticle פולימרים וכל סוג תא של עניין בפורמט צלחת רבה כן.

איור 1 מציג תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי של דוגמה של transfection המוצלח של HRECs עם EGFP פלסמיד. תמונת brightfield כדאי לוודא שתאים לשמור המורפולוגיה הרגילה שלהם. בנוסף, מבחני תא כדאיות, כגון MTS או מבחנים דומים, ניתן להשתמש בו כדי להעריך את רעילויות nanoparticle 7. cytometry זרימה,...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry at JoVE.com

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

פרוטוקול לניתוח nanoparticle מעקב (נ.ת. ע) והזרימה cytometry תפוקה גבוהה להעריך חלקיקים פולימריים גן משלוח מתואר. נת&quot;ע מנוצל כדי לאפיין את התפלגות גודל חלקיקי nanoparticle והפצת החלקיקים לפלסמיד. cytometry זרימת תפוקה גבוהה מאפשר הערכת יעילות transfection כמוני לספרייה של biomaterials מסירת הגן.

הערכת משלוח גן פולימרית חלקיקים על ידי Nanoparticle מעקב ניתוח וזרימת cytometry תפוקה גבוהה

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

גיבוש חלקיקים פולימריים Diblock באמצעות טכניקה Nanoprecipitation

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Microarrays פולימר לגילוי תפוקה גבוהה של Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

סינתזה קומבינטורית של שחרור חלבון ותפוקה גבוהה מסרט הפולימר וספריות Nanoparticle

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

ניתוח הפנמה נייד של חלקיקים וחיידקים על ידי Cytometry Multi-Flow דימות ספקטרלי

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

תפוקה גבוהה סינתזה של פחמימות functionalization של חלקיקים Polyanhydride

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

ייצור מערך microneedle פולימרית יתוגרפיה

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

יישומי ייצור משלוח סמים של חלקיקי משי

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

בידוד של תאים ראשיים Murine הרשתית גנגליון (RGCs) על ידי זרימת cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

השימוש תפוקה גבוהה אוטומטית Microbioreactor מערכת לייצור של מודל IgG1 בתאים צ'ו

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

פלאש NanoPrecipitation בשביל העטיפה של תרכובות הידרופוביות, הידרופילית חלקיקים פולימרים

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...