Name: evaluation of polymeric gene delivery nanoparticles by nanoparticle tracking analysis and high-throughput flow cytometry
Uploaded: 2013-03-01T12:00:00
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Gli autori ringraziano il MSCRF TEDCO (2009-MSCRFE-0098-00) e NIH R21CA152473 per il supporto.

1. Semina cellulare <ol><li> Non consentono alle cellule di crescere fino a overconfluency. Utilizzare le cellule di passaggio in anticipo in cui trasfezione delle cellule primarie. </li><li> Ventiquattro ore prima della trasfezione, le cellule Tripsinizzare, contare le cellule utilizzando un emocitometro, e diluire la sospensione cellulare con supporti per ottenere la densità cellulare desiderata (cellule / volume). Cellule nel tessuto semi trasparente cultura trattata con fondo piatto da 96 pozzetti con un serbatoi...

<ol>
	<li>Putnam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymers+for+gene+delivery+across+length+scales.">Polymers for gene delivery across length scales.</a> Nature Materials. 5, 439-451 (2006).</li><li>Sheyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+cells+in+regenerative+medicine+and+tissue+engineering.">Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7297-7301 (1995).</li><li>Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rita+Schaffer+Lecture:+Nanoparticles+for+Intracellular+Nucleic+Acid+Delivery.">Rita Schaffer Lecture: Nanoparticles for Intracellular Nucleic Acid Delivery.</a> Ann. Biomed. Eng. 40, 1408-1418 (2011).</li><li>Lynn, D. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradable+poly(beta-amino+esters):+Synthesis,+characterization,+and+self-assembly+with+plasmid+DNA.">Degradable poly(beta-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA.</a> J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).</li><li>Sunshine, J. C., Peng, D. Y., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+transfection+with+polymeric+nanoparticles+are+dependent+on+polymer+end-group+structure,+but+largely+independent+of+nanoparticle+physical+and+chemical+properties.">Uptake and transfection with polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure, but largely independent of nanoparticle physical and chemical properties.</a> Mol. Pharm. , (2012).</li><li>Shmueli, R. B., Sunshine, J. C., Xu, Z., Duh, E. J., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+nanoparticles+specific+for+human+microvasculature+and+macrovasculature.">Gene delivery nanoparticles specific for human microvasculature and macrovasculature.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. , (2012).</li><li>Bhise, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+terminal+functionalization+and+molecular+weight+of+a+gene+delivery+polymer+and+transfection+efficacy+in+mammary+epithelial+2-D+cultures+and+3-D+organotypic+cultures.">The relationship between terminal functionalization and molecular weight of a gene delivery polymer and transfection efficacy in mammary epithelial 2-D cultures and 3-D organotypic cultures.</a> Biomaterials. 31, 8088-8096 (2010).</li><li>Tzeng, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+gene+delivery+nanoparticles+based+on+poly(beta-amino+esters)+for+treatment+of+glioblastoma.">Non-viral gene delivery nanoparticles based on poly(beta-amino esters) for treatment of glioblastoma.</a> Biomaterials. 32, 5402-5410 (2011).</li><li>Sunshine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule+End-Groups+of+Linear+Polymer+Determine+Cell-Type+Gene-Delivery+Efficacy.">Small-Molecule End-Groups of Linear Polymer Determine Cell-Type Gene-Delivery Efficacy.</a> Adv. Mater. 21, 4947 (2009).</li><li>Bhise, N. S., Shmueli, R. B., Gonzalez, J., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+quantifying+the+number+of+plasmids+encapsulated+by+polymer+nanoparticles.">A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles.</a> Small. 8, 367-373 (2012).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences.">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li><li>Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+intracellular+stability+and+unpacking+of+DNA+nanocomplexes+by+quantum+dots-FRET.">Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET.</a> Journal of Controlled Release: Official journal of the Controlled Release Society. 116, 83-89 (2006).</li><li>Kreiss, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+DNA+size+does+not+affect+the+physicochemical+properties+of+lipoplexes+but+modulates+gene+transfer+efficiency.">Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency.</a> Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).</li><li>Pitard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-sized+self-assembling+lamellar+complexes+between+plasmid+DNA+and+cationic+micelles+promote+gene+transfer.">Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14412-14417 (1997).</li><li>Collins, L., Kaszuba, M., Fabre, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+solution+of+(Lys)(16)-containing+bifunctional+synthetic+peptide/DNA+nanoparticles+for+gene+delivery.">Imaging in solution of (Lys)(16)-containing bifunctional synthetic peptide/DNA nanoparticles for gene delivery.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1672, 12-20 (2004).</li><li>Green, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+polymeric+vectors+for+gene+delivery+to+human+endothelial+cells.">Biodegradable polymeric vectors for gene delivery to human endothelial cells.</a> Bioconjug. Chem. 17, 1162-1169 (2006).</li></ol>

I protocolli sopra descrivono metodi di valutazione dell&#39;efficacia trasfezione di formulazioni di nanoparticelle, così come un modo per caratterizzare la dimensione delle particelle e caricamento DNA delle nanoparticelle. Il numero di plasmidi per particella è un parametro importante che può aiutare a prevedere l&#39;efficacia della particella e può essere utilizzato anche per la determinazione della dose. Monitoraggio analisi delle nanoparticelle può essere eseguita in una gamma di differenti soluzioni acquose...

La determinazione del numero di plasmidi complessati per nanoparticelle è importante progettare nanoparticelle efficaci strategie basate consegna del gene, in particolare per co-fornitura di plasmidi multipli al bersaglio stessa cella, come spesso è richiesto in cellule staminali riprogrammazione studi 12. Alcuni approcci per calcolare il numero di plasmidi associati a una singola nanoparticella sono stati descritti, e ogni approccio ha degli inconvenienti nelle tecniche utilizzate per la stima 13-16. Quantum dot (QD) etichettatura combinata con TEM è stato utilizzato per stimare plasmidi per particella in chitosano base di nanoparticelle. Stima con questa tecnica QD è complicato a causa della necessità di etichettare il DNA, che potrebbero alterarne le proprietà auto-assemblaggio, la possibilità che incapsulato DNA non marcato non è direttamente rilevato; plasmidi potenzialmente sovrapposti e QDs nelle immagini TEM 2D di particelle, e altre ipotesi semplificatrici 13. Un approccio alternativo, che è unApplicabile quando microdomini ordinati esistono in particelle è stato utilizzato per studiare Lipopolyamine-DNA mediante crio-microscopia elettronica a trasmissione (crio-TEM), X-ray scattering e light scattering dinamico (DLS) 14,15. Purtroppo, materiali come le nanoparticelle polimeriche esaminati qui non sono applicabili in questo metodo. . In un altro studio, Collins et al utilizzata una particella flusso tecnica di analisi di immagine per studiare (Lys) 16-peptide contenente / DNA, tuttavia, il metodo può valutare, grandi dimensioni micron particelle 16. Così, abbiamo recentemente messo a punto un nuovo metodo di analisi e flessibile per quantificare il numero di plasmidi nanoparticelle per 11.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagente </td></tr><tr><td> Soluzione tampone fosfato, 1x (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 10010 </td><td></td></tr><tr><td> EGM-2MV BulletKit </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Invitrogen </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> Tampone acetato di sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7899 </td><td> Diluire a 25 mM in acqua deionizzata </td></tr><tr><td> Dimetilsolfossido </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 276855 </td><td></td></tr><tr><td> pEGFP DNA </td><td> Elim Biopharmaceuticals </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> DNA DsRed </td><td> Addgene </td><td> 21718 </td><td></td></tr><tr><td> PEI, ramificato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 408727 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> CellTiter 96 acquose One </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Materiale </td></tr><tr><td> Cancella fondo piatto piastra a 96 pozzetti, sterile </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1581.001 </td><td></td></tr><tr><td> Cancella fondo rotondo piastra a 96 pozzetti, sterile </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1582.001 </td><td></td></tr><tr><td> 12 canali Finnpipette </td><td> Thermo Scientific </td><td> NA </td><td> 5-50 e 50-300 microlitri </td></tr><tr><td> Microscopio a fluorescenza </td><td> Zeiss </td><td> NA </td><td> Numero di modello: AX10 </td></tr><tr><td> C6 Accuri citofluorimetro </td><td> BD Biosciences </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> HyperCyt allegato </td><td> Intellicyt </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> NS500</td><td> NanoSight </td><td> NA </td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of polymeric gene delivery nanoparticles by nanoparticle tracking analysis and high-throughput flow cytometry

Non virale trasferimento genico utilizzando nanoparticelle polimeriche è emerso come un approccio interessante per la terapia genica per trattare malattie genetiche 1 e come una tecnologia per la medicina rigenerativa 2. A differenza dei virus, che hanno notevoli problemi di sicurezza, nanoparticelle polimeriche possono essere progettati per essere non tossico, non immunogenica, non mutagena, più facile da sintetizzare chimicamente versatile, in grado di trasportare più carichi di acido nucleico e biodegradabili e / o l&#39;ambiente reattivo. Polimeri cationici auto-assemblano con DNA carico negativamente tramite interazione elettrostatica per formare complessi dell&#39;ordine di 100 nm, che sono comunemente denominate nanoparticelle polimeriche. Esempi di biomateriali utilizzati per formare nanoscala policationici nanoparticelle di consegna del gene includono polilisina, polyphosphoesters, poli (amidoamines) s e polietilenimmina (PEI), che è un non-degradabile off-the-shelf polimero cationico comunemente utilizzato per la consegna di acido nucleico 1,3. Poli (beta-amminoestere) s (PBAEs) sono una nuova classe di polimeri cationici 4 che sono idroliticamente degradabili 5,6 e hanno dimostrato di essere efficace nel gene delivery a hard-trasfezione tipi cellulari quali cellule endoteliali retiniche (HRECs) 7, topo cellule epiteliali mammarie 8, cervello umano cellule tumorali 9 e macrovascolari (vena ombelicale umana, HUVEC), cellule endoteliali 10. Un nuovo protocollo per caratterizzare nanoparticelle polimeriche che utilizzano l&#39;analisi delle nanoparticelle di monitoraggio (NTA) è descritto. In questo approccio, sia la distribuzione della dimensione delle particelle e la distribuzione del numero di plasmidi per particella si ottengono 11. Inoltre, un elevato throughput a 96 pozzetti per saggio di transfezione piastra screening rapido dell&#39;efficacia trasfezione di nanoparticelle polimeriche è presentato. In questo protocollo, poli (beta-ammino estere) s (PBAEs) sono usati come modello polimeri e cellule retiniche umane endoteliali (HRECs) sono usati come modEL cellule umane. Questo protocollo può essere facilmente adattato per valutare qualsiasi nanoparticella polimerica e qualsiasi tipo di cellule in un multi-pozzetto formato lastra.

La figura 1 mostra una immagine di fluorescenza microscopia di un esempio di trasfezione successo HRECs con il plasmide EGFP. L&#39;immagine brightfield è utile per garantire che le cellule mantengono la loro morfologia normale. Inoltre, saggi di vitalità cellulare, come saggi MTS o simili, può essere utilizzato per valutare la tossicità delle nanoparticelle 7. Citometria a flusso, come descritto, può essere usato per quantificare l&#39;efficienza di trasfezione. Quando si utilizza il Hy...

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Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Un protocollo per l&#39;analisi delle nanoparticelle di monitoraggio (NTA) e high-throughput citometria a flusso per valutare nanoparticelle polimeriche consegna del gene è descritto. NTA è utilizzato per caratterizzare la distribuzione delle particelle nanoparticelle dimensioni e la distribuzione delle particelle per plasmide. High-throughput citometria a flusso consente quantitativa valutazione di efficacia di trasfezione per una libreria di biomateriali di consegna del gene.

Valutazione della consegna del gene polimerici Nanoparticelle per l&#39;analisi delle nanoparticelle Monitoraggio e High-throughput Citometria a Flusso

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Ricerca

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