Name: evaluation of polymeric gene delivery nanoparticles by nanoparticle tracking analysis and high-throughput flow cytometry
Uploaded: 2013-03-01T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry at JoVE.com

Forfatterne takke TEDCO MSCRF (2009-MSCRFE-0098-00) og NIH R21CA152473 for støtte.

1. Cell Seeding <ol><li> Ikke la cellene til å vokse til overconfluency. Bruk tidlig passasje cellene når transfecting primærceller. </li><li> Tjuefire timer før transfeksjon, trypsinize cellene, telle cellene ved hjelp av en hemocytometer, og fortynn cellesuspensjonen med media for å oppnå den ønskede celletetthet (celler / volum). Seed celler til klar vevskultur-behandlet flatbunnede 96-brønners plater ved bruk av en reservoar-og flerkanals pipetter. Den valgte tetthet bør gi 70-80% sammenflyting den dagen ...

<ol>
	<li>Putnam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymers+for+gene+delivery+across+length+scales.">Polymers for gene delivery across length scales.</a> Nature Materials. 5, 439-451 (2006).</li><li>Sheyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+cells+in+regenerative+medicine+and+tissue+engineering.">Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7297-7301 (1995).</li><li>Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rita+Schaffer+Lecture:+Nanoparticles+for+Intracellular+Nucleic+Acid+Delivery.">Rita Schaffer Lecture: Nanoparticles for Intracellular Nucleic Acid Delivery.</a> Ann. Biomed. Eng. 40, 1408-1418 (2011).</li><li>Lynn, D. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradable+poly(beta-amino+esters):+Synthesis,+characterization,+and+self-assembly+with+plasmid+DNA.">Degradable poly(beta-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA.</a> J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).</li><li>Sunshine, J. C., Peng, D. Y., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+transfection+with+polymeric+nanoparticles+are+dependent+on+polymer+end-group+structure,+but+largely+independent+of+nanoparticle+physical+and+chemical+properties.">Uptake and transfection with polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure, but largely independent of nanoparticle physical and chemical properties.</a> Mol. Pharm. , (2012).</li><li>Shmueli, R. B., Sunshine, J. C., Xu, Z., Duh, E. J., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+nanoparticles+specific+for+human+microvasculature+and+macrovasculature.">Gene delivery nanoparticles specific for human microvasculature and macrovasculature.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. , (2012).</li><li>Bhise, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+terminal+functionalization+and+molecular+weight+of+a+gene+delivery+polymer+and+transfection+efficacy+in+mammary+epithelial+2-D+cultures+and+3-D+organotypic+cultures.">The relationship between terminal functionalization and molecular weight of a gene delivery polymer and transfection efficacy in mammary epithelial 2-D cultures and 3-D organotypic cultures.</a> Biomaterials. 31, 8088-8096 (2010).</li><li>Tzeng, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+gene+delivery+nanoparticles+based+on+poly(beta-amino+esters)+for+treatment+of+glioblastoma.">Non-viral gene delivery nanoparticles based on poly(beta-amino esters) for treatment of glioblastoma.</a> Biomaterials. 32, 5402-5410 (2011).</li><li>Sunshine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule+End-Groups+of+Linear+Polymer+Determine+Cell-Type+Gene-Delivery+Efficacy.">Small-Molecule End-Groups of Linear Polymer Determine Cell-Type Gene-Delivery Efficacy.</a> Adv. Mater. 21, 4947 (2009).</li><li>Bhise, N. S., Shmueli, R. B., Gonzalez, J., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+quantifying+the+number+of+plasmids+encapsulated+by+polymer+nanoparticles.">A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles.</a> Small. 8, 367-373 (2012).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences.">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li><li>Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+intracellular+stability+and+unpacking+of+DNA+nanocomplexes+by+quantum+dots-FRET.">Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET.</a> Journal of Controlled Release: Official journal of the Controlled Release Society. 116, 83-89 (2006).</li><li>Kreiss, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+DNA+size+does+not+affect+the+physicochemical+properties+of+lipoplexes+but+modulates+gene+transfer+efficiency.">Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency.</a> Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).</li><li>Pitard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-sized+self-assembling+lamellar+complexes+between+plasmid+DNA+and+cationic+micelles+promote+gene+transfer.">Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14412-14417 (1997).</li><li>Collins, L., Kaszuba, M., Fabre, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+solution+of+(Lys)(16)-containing+bifunctional+synthetic+peptide/DNA+nanoparticles+for+gene+delivery.">Imaging in solution of (Lys)(16)-containing bifunctional synthetic peptide/DNA nanoparticles for gene delivery.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1672, 12-20 (2004).</li><li>Green, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+polymeric+vectors+for+gene+delivery+to+human+endothelial+cells.">Biodegradable polymeric vectors for gene delivery to human endothelial cells.</a> Bioconjug. Chem. 17, 1162-1169 (2006).</li></ol>

Protokollene over beskriver metoder for å evaluere effekten av transfeksjon nanopartikkel formuleringer, så vel som en måte å karakterisere partikkelstørrelsen og DNA lasting av nanopartikler. Antallet plasmider per partikkel er en viktig parameter som kan bidra til å forutsi effektiviteten av partikkelen, og kan også brukes for dosebestemmelse. Nanopartikkel sporing analyse kan utføres i en rekke forskjellige vandige oppløsninger, slik som de forskjellige i saltkonsentrasjonen. Ofte denne karakteristikken er u...

Bestemmelsen av antall plasmider kompleksbundet per nanopartikkel er viktig å utforme effektive nanopartikkel-baserte genet levering strategier, spesielt for co-levering av flere plasmider til samme celle målet, som ofte er nødvendig i stamcelleforskningen omprogrammering studier 12. Noen tilnærminger for å beregne antall plasmider forbundet med en enkelt nanopartikkel er beskrevet, og hver tilnærming har ulemper i de teknikkene som brukes for estimering 13-16. Kvante prikk (QD) merking kombinert med TEM har blitt brukt til å beregne plasmider per partikkel i kitosan-baserte nanopartikler. Estimering med dette QD teknikken er komplisert på grunn av behovet for å merke DNA, som kan endre sin selv-montering egenskaper, muligheten for at innkapslet umerket DNA ikke er direkte detektert; potensielt overlappende plasmider og QDs i 2D TEM bilder av partikler, og andre forenklende forutsetninger 13. En alternativ tilnærming som er enpplicable når bestilt microdomains finnes i partiklene har blitt brukt til å studere Lipopolyamine-DNA komplekser via Cryo-transmisjonselektronmikroskopi (Cryo-TEM), X-ray spredning, og dynamisk lysspredning (DLS) 14,15. Dessverre, materialer som de polymere nanopartikler undersøkt her er ikke aktuelt med denne metoden. I en annen studie, brukte Collins et al en flyt partikkel bildeanalyse teknikk for å studere (Lys) 16-inneholdende peptid / DNA komplekser,. Kan imidlertid deres metode bare vurdere større, mikron-størrelse partikler 16. Således vi nylig utviklet en ny og fleksibel assay å kvantifisere antallet plasmider pr nanopartikkel 11.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Fosfatbufret saltvann, 1x (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 10010 </td><td></td></tr><tr><td> EGM-2 mV BulletKit </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Invitrogen </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumacetatbuffer </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7899 </td><td> Fortynn til 25mm i avionisert vann </td></tr><tr><td> Dimetylsulfoksid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 276855 </td><td></td></tr><tr><td> pEGFP DNA </td><td> Elim Biopharmaceuticals </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> DsRed DNA </td><td> Addgene </td><td> 21718 </td><td></td></tr><tr><td> PEI, forgrenet </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 408727 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> CellTiter 96 vandig One </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Materialer </td></tr><tr><td> Tøm flat bunn 96-brønners plate, steril </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1581.001 </td><td></td></tr><tr><td> Tøm rundbunnet 96-brønns plate, steril </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1582.001 </td><td></td></tr><tr><td> 12-kanals Finnpipette </td><td> Thermo Scientific </td><td> NA </td><td> 5-50 og 50-300 ul </td></tr><tr><td> Fluorescens mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> NA </td><td> Modellnummer: AX10 </td></tr><tr><td> C6 Accuri strømningscytometeret </td><td> BD Biosciences </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> HyperCyt vedlegg </td><td> Intellicyt </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> NS500</td><td> NanoSight </td><td> NA </td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of polymeric gene delivery nanoparticles by nanoparticle tracking analysis and high-throughput flow cytometry

Ikke-virale genet levering hjelp polymere nanopartikler har dukket opp som en attraktiv metode for genterapi for å behandle genetiske sykdommer 1 og som en teknologi for regenerativ medisin 2. Motsetning til virus, som har betydelige sikkerhetsaspekter, kan polymere nanopartikler utformes for å være ikke-giftig, ikke-immunogene, ikke-mutagent, enklere å syntetisere, kjemisk allsidig, stand til å bære større nukleinsyre last og biologisk nedbrytbare og / eller miljømessig responsive. Kationiske polymerer selv montere med negativt ladet DNA via elektrostatisk interaksjon for å danne komplekser på størrelsesorden 100 nm som ofte benevnes polymere nanopartikler. Eksempler biomaterialer brukes til å danne nanoskala polykationiske genet levering nanopartikler omfatter polylysin, polyphosphoesters, poly (amidoamines) s og polyetylenimin (PEI), som er en ikke-nedbrytbar off-the-sokkel kationisk polymer som vanligvis brukes for nukleinsyre produksjonstid 1,3. Poly (beta-aminoester) s (PBAEs) er en nyere klasse av kationiske polymerer 4 som er hydrolytisk nedbrytbare 5,6 og har vist seg å være effektive på genet levering til vanskelig å transfektere celletyper som humane retinale endotelceller (HRECs) 7, mus mammary epitelceller 8, menneskelige hjerne kreftceller 9 og makrovaskulære (human umbilical vein, HUVECs) endotelceller 10. En ny-protokollen for å karakterisere polymere nanopartikler utnytte nanopartikkel sporing analyse (NTA), er beskrevet. I denne tilnærmingen blir både partikkelstørrelsesfordelingen og fordelingen av antall plasmider per partikkel innhentet 11. I tillegg er en high-throughput 96-brønns plate transfeksjon analysen for rask screening av transfeksjon effekten av polymere nanopartikler presentert. I denne protokollen, er poly (beta-amino-ester) s (PBAEs) brukt som modell polymerer og humane retinal endotelceller (HRECs) brukes som model menneskeceller. Denne protokollen kan lett tilpasses for å evaluere eventuelle polymert nanopartikkel og enhver celletype av interesse i en multi-brønn plate-format.

Fig. 1 viser et fluorescensmikroskopi bilde av et eksempel på en vellykket transfeksjon av HRECs med EGFP plasmid. Den lysfelt Bildet er nyttig for å sikre at cellene opprettholde deres vanlige morfologi. Tillegg kan celleviabilitet analyser, for eksempel MTS eller lignende undersøkelser, brukes til å vurdere nanopartikkel toksisitet 7. Flowcytometri, som beskrevet, kan brukes til å kvantifisere transfeksjon effektivitet. Ved bruk av HyperCyt flerbrønns plate vedlegg, vil dataene som m?...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry at JoVE.com

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

En protokoll for nanopartikkel sporing analyse (NTA) og high-throughput flowcytometri å vurdere polymere genet levering nanopartikler er beskrevet. NTA utnyttes for å karakterisere nanopartikkel partikkelstørrelsesfordeling og plasmidet per partikkel fordeling. High-throughput flowcytometri gjør kvantitative transfeksjon effektevalueringen for et bibliotek av genet levering biomaterialer.

Evaluering av polymere Gene levering Nanopartikler av nanopartikler Tracking Analysis og High-throughput flowcytometri

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Kombinatorisk Syntese av og High-throughput Protein År fra Polymer Film og nanopartikler Libraries

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

High-throughput syntese av karbohydrater og funksjonalisering av Polyanhydride Nanopartikler

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

Polymer Microneedle Array Fabrikasjon av Fotolitografi

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Produksjon og levering av legemidler Anvendelser av Silk Nanopartikler

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Isolering av primære murin retinale Ganglion-celler (RGCer) ved Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Bruk av høy gjennomstrømming automatisert Microbioreactor System for produksjon av modellen IgG1 i CHO celler

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

Flash NanoPrecipitation for innkapsling av hydrofobe og hydrofile forbindelser i polymere nanopartikler

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...