Name: evaluation of polymeric gene delivery nanoparticles by nanoparticle tracking analysis and high-throughput flow cytometry
Uploaded: 2013-03-01T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry at JoVE.com

Авторы благодарят TEDCO MSCRF (2009-MSCRFE-0098-00) и NIH R21CA152473 за поддержку.

1. Сотовые Сеялки <ol><li> Не позволять клеткам расти в overconfluency. Используйте ранних клеток при прохождении трансфекции первичных клеток. </li><li> Двадцать четыре часа до трансфекции trypsinize клеток, подсчет клеток с использованием гемоцитометр, и развести суспензию клеток со средствами массов?...

<ol>
	<li>Putnam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymers+for+gene+delivery+across+length+scales.">Polymers for gene delivery across length scales.</a> Nature Materials. 5, 439-451 (2006).</li><li>Sheyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+cells+in+regenerative+medicine+and+tissue+engineering.">Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7297-7301 (1995).</li><li>Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rita+Schaffer+Lecture:+Nanoparticles+for+Intracellular+Nucleic+Acid+Delivery.">Rita Schaffer Lecture: Nanoparticles for Intracellular Nucleic Acid Delivery.</a> Ann. Biomed. Eng. 40, 1408-1418 (2011).</li><li>Lynn, D. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradable+poly(beta-amino+esters):+Synthesis,+characterization,+and+self-assembly+with+plasmid+DNA.">Degradable poly(beta-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA.</a> J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).</li><li>Sunshine, J. C., Peng, D. Y., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+transfection+with+polymeric+nanoparticles+are+dependent+on+polymer+end-group+structure,+but+largely+independent+of+nanoparticle+physical+and+chemical+properties.">Uptake and transfection with polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure, but largely independent of nanoparticle physical and chemical properties.</a> Mol. Pharm. , (2012).</li><li>Shmueli, R. B., Sunshine, J. C., Xu, Z., Duh, E. J., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+nanoparticles+specific+for+human+microvasculature+and+macrovasculature.">Gene delivery nanoparticles specific for human microvasculature and macrovasculature.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. , (2012).</li><li>Bhise, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+terminal+functionalization+and+molecular+weight+of+a+gene+delivery+polymer+and+transfection+efficacy+in+mammary+epithelial+2-D+cultures+and+3-D+organotypic+cultures.">The relationship between terminal functionalization and molecular weight of a gene delivery polymer and transfection efficacy in mammary epithelial 2-D cultures and 3-D organotypic cultures.</a> Biomaterials. 31, 8088-8096 (2010).</li><li>Tzeng, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+gene+delivery+nanoparticles+based+on+poly(beta-amino+esters)+for+treatment+of+glioblastoma.">Non-viral gene delivery nanoparticles based on poly(beta-amino esters) for treatment of glioblastoma.</a> Biomaterials. 32, 5402-5410 (2011).</li><li>Sunshine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule+End-Groups+of+Linear+Polymer+Determine+Cell-Type+Gene-Delivery+Efficacy.">Small-Molecule End-Groups of Linear Polymer Determine Cell-Type Gene-Delivery Efficacy.</a> Adv. Mater. 21, 4947 (2009).</li><li>Bhise, N. S., Shmueli, R. B., Gonzalez, J., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+quantifying+the+number+of+plasmids+encapsulated+by+polymer+nanoparticles.">A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles.</a> Small. 8, 367-373 (2012).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences.">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li><li>Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+intracellular+stability+and+unpacking+of+DNA+nanocomplexes+by+quantum+dots-FRET.">Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET.</a> Journal of Controlled Release: Official journal of the Controlled Release Society. 116, 83-89 (2006).</li><li>Kreiss, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+DNA+size+does+not+affect+the+physicochemical+properties+of+lipoplexes+but+modulates+gene+transfer+efficiency.">Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency.</a> Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).</li><li>Pitard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-sized+self-assembling+lamellar+complexes+between+plasmid+DNA+and+cationic+micelles+promote+gene+transfer.">Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14412-14417 (1997).</li><li>Collins, L., Kaszuba, M., Fabre, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+solution+of+(Lys)(16)-containing+bifunctional+synthetic+peptide/DNA+nanoparticles+for+gene+delivery.">Imaging in solution of (Lys)(16)-containing bifunctional synthetic peptide/DNA nanoparticles for gene delivery.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1672, 12-20 (2004).</li><li>Green, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+polymeric+vectors+for+gene+delivery+to+human+endothelial+cells.">Biodegradable polymeric vectors for gene delivery to human endothelial cells.</a> Bioconjug. Chem. 17, 1162-1169 (2006).</li></ol>

Протоколы выше, описывают методы оценки эффективности трансфекции наночастиц составов, а также способ охарактеризовать размер частицы и ДНК загрузки наночастиц. Количество плазмид на одну частицу является важным параметром, который может помочь предсказать эффективность частиц, а т...

Определение количества плазмид комплекс в наночастицы важно разработать эффективную основе наночастиц доставки генов стратегии, в частности, для совместного осуществления различных плазмид с тем же клетки-мишени, как это часто требуется в перепрограммировании стволовых клеток исследования 12. Несколько подходов к подсчитать число плазмид, связанные с одной наночастицы были описаны, и каждый подход имеет свои недостатки в методах, используемых для оценки 13-16. Квантовые точки (КТ) маркировка в сочетании с ТЕА была использована для оценки плазмид на одну частицу в основе хитозана наночастиц. Оценка этой QD техника сложна в связи с необходимостью для обозначения ДНК, который может изменить его самостоятельной сборки свойств; возможность того, что инкапсулированные немеченых ДНК непосредственно не обнаружено; потенциально перекрывающихся плазмид и КТ в 2D-изображений ПЭМ частиц, и другие упрощающие предположения 13. Альтернативный подход, которыйpplicable при заказе микродоменов существуют в частицы были использованы для изучения Lipopolyamine-комплексов ДНК с помощью крио-электронной микроскопии (крио-TEM), рассеяния рентгеновских лучей и динамического рассеяния света (DLS) 14,15. К сожалению, материалы, такие как полимерные наночастицы исследовали здесь не применимы с этим методом. . В другом исследовании, Collins и др. использовали изображения потока частиц методики анализа для изучения (Lys) 16-содержащий пептид / ДНК, однако их метод может оценить только большие, частиц микронного размера 16. Таким образом, мы недавно разработали новый и гибкий анализ для количественного определения количества плазмид в наночастицы 11.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Реагент </td></tr><tr><td> Фосфатным буферным раствором, 1x (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 10010 </td><td></td></tr><tr><td> EGM-2MV BulletKit </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td></td></tr><tr><td> Трипсин </td><td> Invitrogen </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> Буфере ацетата натрия </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7899 </td><td> Разбавить до 25 мм в деионизированной воде </td></tr><tr><td> Диметилсульфоксид </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 276855 </td><td></td></tr><tr><td> pEGFP ДНК </td><td> Элим Biopharmaceuticals </td><td> Не Доступно </td><td></td></tr><tr><td> DsRed ДНК </td><td> Addgene </td><td> 21718 </td><td></td></tr><tr><td> PEI, разветвленные </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 408727 </td> &lt;TD&gt; </td></tr><tr><td> CellTiter 96 водную </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Материалы </td></tr><tr><td> Ясно плоским дном 96-луночный планшет, стерильный </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1581.001 </td><td></td></tr><tr><td> Ясно круглым дном 96-луночный планшет, стерильный </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1582.001 </td><td></td></tr><tr><td> 12-канальный Finnpipette </td><td> Thermo Scientific </td><td> Не Доступно </td><td> 5-50 и 50-300 мкл </td></tr><tr><td> Флуоресцентного микроскопа </td><td> Zeiss </td><td> Не Доступно </td><td> Номер модели: AX10 </td></tr><tr><td> C6 Accuri проточной цитометрии </td><td> BD Biosciences </td><td> Не Доступно </td><td></td></tr><tr><td> HyperCyt вложения </td><td> Intellicyt </td><td> Не Доступно </td><td></td></tr><tr><td> NS500</td><td> NanoSight </td><td> Не Доступно </td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of polymeric gene delivery nanoparticles by nanoparticle tracking analysis and high-throughput flow cytometry

Non-вирусной доставки генов с использованием полимерных наночастиц стала привлекательной подход к генной терапии для лечения генетических заболеваний 1 и в качестве технологии для регенеративной медицины 2. В отличие от вирусов, которые имеют значительные проблемы безопасности, полимерные наночастицы могут быть разработаны, чтобы быть нетоксичным, неиммуногенных, не мутагенными, легче синтезировать химически универсальный, способный перевозить большие грузы нуклеиновых кислот и биологически и / или экологические требования. Катионные полимеры самостоятельно собираться с отрицательно заряженной ДНК с помощью электростатического взаимодействия образовывать комплексы порядка 100 нм, которые обычно называют полимерные наночастицы. Примеры биоматериалы используется для формирования наноразмерных поликатионный наночастиц доставки генов включают полилизин, polyphosphoesters, поли (амидоамины) с и полиэтиленимина (PEI), который является неразлагаемых вне-полки катионного полимера обычно используется для доставки нуклеиновых кислот 1,3. Поли (бета-аминоэфир) с (PBAEs) являются новым классом катионных полимеров 4, которые гидролитически разлагающиеся 5,6 и были показаны, чтобы быть эффективным при доставки генов в труднодоступных трансфекции типы клеток, такие как человеческие эндотелиальные клетки сетчатки (HRECs) 7, мышь эпителиальные клетки молочной железы 8, человеческий мозг раковых клеток 9 и макрососудистых (пупочной вены человека, HUVEC) эндотелиальных клеток 10. Новый протокол для характеристики полимерных наночастиц использованием наночастиц отслеживания анализа (NTA) описано. При таком подходе, как распределение частиц по размерам и распределению число плазмид на одну частицу получены 11. Кроме того, высокую пропускную способность 96-луночный планшет для анализа трансфекции для быстрого скрининга трансфекции эффективности полимерных наночастиц представлены. В этом протоколе, поли (бета-амино эфир) с (PBAEs) используются в качестве модели полимеров и человеческие эндотелиальные клетки сетчатки (HRECs) используются в качестве движениядель клетки человека. Этот протокол может быть легко адаптирована для оценки любых полимерных наночастиц и любой тип клеток интересов в мульти-луночный планшет формата.

На рисунке 1 показано изображение флуоресценции микроскопии пример успешной трансфекции HRECs с EGFP плазмиды. Образ светлого полезно убедиться, что клетки сохраняют свою обычную морфологию. Кроме того, жизнеспособность клеток анализы, такие как МТС или аналогичные анализы, може?...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry at JoVE.com

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Протокол для наночастиц отслеживания анализа (NTA) и высокой пропускной проточной цитометрии для оценки полимерных наночастиц доставки генов описано. НТА используется для характеристики размеров наночастиц распределения частиц и плазмиды в распределении частиц. Высокая пропускная способность проточной цитометрии позволяет количественной оценки эффективности трансфекции для библиотеки биоматериалов доставки генов.

Оценка Полимерные доставки генов наночастиц наночастиц Анализ отслеживания и высокой пропускной проточной цитометрии

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Формулировка диблок Полимерные наночастицы через Nanoprecipitation Техника

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Полимерные Microarrays высоких Discovery Пропускная биоматериалов

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Комбинаторного синтеза и высокая пропускная способность белка Освобождение от полимерной пленки и наночастицы библиотеки

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Анализируя сотовой Интернализация наночастиц и бактерий нескольких спектральных изображений проточной цитометрии

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Высокая пропускная способность синтеза углеводов и Функционализация Polyanhydride наночастиц

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

Полимерные микроиглы массив Изготовление по фотолитографии

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Производство и поставка снадобья Применение шелкового наночастицами

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Выделение первичных клеток сетчатки сетчатки (RGCs) проточной цитометрией

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Использование высокопроизводительного автоматизированная система Microbioreactor для производства модель IgG1 в клетках Чо

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

Флэш-NanoPrecipitation для инкапсуляции гидрофобных и гидрофильных соединений в полимерных наночастиц

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...