Name: evaluation of polymeric gene delivery nanoparticles by nanoparticle tracking analysis and high-throughput flow cytometry
Uploaded: 2013-03-01T12:00:00
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Los autores agradecen al MSCRF TEDCO (2009-MSCRFE-0098-00) y NIH R21CA152473 de apoyo.

1. Siembra Celular <ol><li> No permitir que las células crezcan a overconfluency. Usar células tempranas de paso cuando la transfección de células primarias. </li><li> Veinticuatro horas antes de la transfección, Tripsinizar las células, se cuentan las células usando un hemocitómetro, y se diluye la suspensión celular con los medios para conseguir la densidad celular deseada (células / volumen). Se siembran las células en el tejido claro cultivo tratado con fondo plano de 96 pocillos utilizando una pipeta m...

<ol>
	<li>Putnam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymers+for+gene+delivery+across+length+scales.">Polymers for gene delivery across length scales.</a> Nature Materials. 5, 439-451 (2006).</li><li>Sheyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+cells+in+regenerative+medicine+and+tissue+engineering.">Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proc. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+transfection+with+polymeric+nanoparticles+are+dependent+on+polymer+end-group+structure,+but+largely+independent+of+nanoparticle+physical+and+chemical+properties.">Uptake and transfection with polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure, but largely independent of nanoparticle physical and chemical properties.</a> Mol. Pharm. , (2012).</li><li>Shmueli, R. B., Sunshine, J. C., Xu, Z., Duh, E. J., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+nanoparticles+specific+for+human+microvasculature+and+macrovasculature.">Gene delivery nanoparticles specific for human microvasculature and macrovasculature.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. , (2012).</li><li>Bhise, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+terminal+functionalization+and+molecular+weight+of+a+gene+delivery+polymer+and+transfection+efficacy+in+mammary+epithelial+2-D+cultures+and+3-D+organotypic+cultures.">The relationship between terminal functionalization and molecular weight of a gene delivery polymer and transfection efficacy in mammary epithelial 2-D cultures and 3-D organotypic cultures.</a> Biomaterials. 31, 8088-8096 (2010).</li><li>Tzeng, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+gene+delivery+nanoparticles+based+on+poly(beta-amino+esters)+for+treatment+of+glioblastoma.">Non-viral gene delivery nanoparticles based on poly(beta-amino esters) for treatment of glioblastoma.</a> Biomaterials. 32, 5402-5410 (2011).</li><li>Sunshine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule+End-Groups+of+Linear+Polymer+Determine+Cell-Type+Gene-Delivery+Efficacy.">Small-Molecule End-Groups of Linear Polymer Determine Cell-Type Gene-Delivery Efficacy.</a> Adv. Mater. 21, 4947 (2009).</li><li>Bhise, N. S., Shmueli, R. B., Gonzalez, J., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+quantifying+the+number+of+plasmids+encapsulated+by+polymer+nanoparticles.">A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles.</a> Small. 8, 367-373 (2012).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences.">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li><li>Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+intracellular+stability+and+unpacking+of+DNA+nanocomplexes+by+quantum+dots-FRET.">Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET.</a> Journal of Controlled Release: Official journal of the Controlled Release Society. 116, 83-89 (2006).</li><li>Kreiss, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+DNA+size+does+not+affect+the+physicochemical+properties+of+lipoplexes+but+modulates+gene+transfer+efficiency.">Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency.</a> Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).</li><li>Pitard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-sized+self-assembling+lamellar+complexes+between+plasmid+DNA+and+cationic+micelles+promote+gene+transfer.">Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer.</a> Proc. 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Los protocolos anteriores describen métodos para evaluar la eficacia de la transfección de las formulaciones de nanopartículas, así como una forma de caracterizar el tamaño de partícula y carga de ADN de las nanopartículas. El número de plásmidos por partícula es un parámetro importante que puede ayudar a predecir la eficacia de la partícula y también se puede utilizar para la determinación de la dosis. Nanopartículas de análisis de seguimiento se puede realizar en una variedad de diferentes soluciones a...

La determinación del número de plásmidos acomplejados por nanopartículas es importante diseñar eficaces estrategias basadas en nanopartículas de suministro de genes, en particular para el cosuministro de los plásmidos múltiples a la misma célula objetivo, como se requiere a menudo en estudios de células madre reprogramación 12. Algunos enfoques para calcular el número de plásmidos asociados con una nanopartícula solo se han descrito, y cada enfoque tiene inconvenientes en las técnicas utilizadas para la estimación de 13-16. Puntos cuánticos (QD) etiquetado combinado con TEM se ha utilizado para estimar plásmidos por partícula en nanopartículas a base de quitosano. Estimación con esta técnica QD es complicado debido a la necesidad de etiquetar el ADN, que puede alterar sus propiedades de autoensamblaje, la posibilidad de que el ADN no marcado encapsulado no se detecta directamente; plásmidos potencialmente superpuestos y QDS en las imágenes de TEM 2D de partículas, y otros supuestos simplificadores 13. Un enfoque alternativo que es unpplicable cuando microdominios ordenados existen en las partículas ha sido utilizado para estudiar el ADN lipopoliamina complejos a través de la crio-microscopía electrónica de transmisión (crio-TEM), dispersión de rayos X, y dispersión de luz dinámica (DLS) 14,15. Desafortunadamente, los materiales tales como las nanopartículas poliméricas aquí investigados no son aplicables con este método. . En otro estudio, Collins et al usaron un flujo de partículas imagen técnica de análisis para estudiar (Lys) 16-que contiene péptido / ADN complejos, sin embargo, su método sólo se puede evaluar más grandes, partículas de tamaño micrométrico 16. Por lo tanto, hemos desarrollado un nuevo ensayo y flexible para cuantificar el número de plásmidos por nanopartícula 11.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reactivo </td></tr><tr><td> Tampón fosfato salino, 1x (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 10010 </td><td></td></tr><tr><td> EGM-2MV BulletKit </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Invitrogen </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> Tampón de acetato sódico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7899 </td><td> Diluir a 25 mM en agua desionizada </td></tr><tr><td> Sulfóxido de dimetilo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 276855 </td><td></td></tr><tr><td> pEGFP ADN </td><td> Elim biofarmacéuticos </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> ADN DsRed </td><td> Addgene </td><td> 21718 </td><td></td></tr><tr><td> PEI, ramificado </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 408727 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> CellTiter 96 Aqueous One </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Materiales </td></tr><tr><td> Borrar fondo plano de 96 pocillos, estériles </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1581.001 </td><td></td></tr><tr><td> Borrar fondo redondo de 96 pocillos, estériles </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1582.001 </td><td></td></tr><tr><td> 12-canales Finnpipette </td><td> Thermo Scientific </td><td> NA </td><td> 5-50 y 50-300 l </td></tr><tr><td> Microscopio de Fluorescencia </td><td> Zeiss </td><td> NA </td><td> Número de modelo: AX10 </td></tr><tr><td> C6 Accuri citómetro de flujo </td><td> BD Biosciences </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> HyperCyt adjunto </td><td> Intellicyt </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> NS500</td><td> NanoSight </td><td> NA </td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of polymeric gene delivery nanoparticles by nanoparticle tracking analysis and high-throughput flow cytometry

No virales de suministro de genes usando nanopartículas poliméricas se ha convertido en un enfoque atractivo para la terapia génica para tratar enfermedades genéticas y 1 como una tecnología para la medicina regenerativa 2. A diferencia de los virus, que tienen problemas de seguridad importantes, las nanopartículas poliméricas se pueden diseñar para ser no tóxico, no inmunogénico, no mutagénico, más fáciles de sintetizar, químicamente versátiles, capaces de llevar a mayor carga de ácido nucleico y biodegradable y / o sensible ambientalmente. Los polímeros catiónicos se auto-ensamblan con ADN cargado negativamente a través de la interacción electrostática para formar complejos del orden de 100 nm que son comúnmente denominadas nanopartículas poliméricas. Ejemplos de biomateriales utilizados para formar nanoescala nanopartículas de suministro de genes policatiónicos incluyen polilisina, polifosfoésteres, poli (amidoaminas) s y polietilenimina (PEI), que es un no-degradable off-the-shelf polímero catiónico comúnmente usado para el suministro de ácido nucleico 1,3. Poli (beta-aminoéster) s (PBAEs) son una nueva clase de polímeros catiónicos 4 que son hidrolíticamente degradables 5,6 y se ha demostrado ser eficaz en la entrega de genes para tipos de células difíciles de transfectar tales como células de la retina humanas endoteliales (HRECs) 7, las células epiteliales mamarias de ratón 8, las células humanas de cáncer de cerebro 9 y macrovasculares (vena umbilical humana, HUVEC) células endoteliales 10. Un nuevo protocolo para caracterizar las nanopartículas poliméricas que utilizan nanopartículas de análisis de seguimiento (NTA) se describe. En este enfoque, tanto la distribución del tamaño de partícula y la distribución del número de plásmidos por partícula se obtienen 11. Además, una placa de ensayo de alto rendimiento de transfección de 96 pocillos para la detección rápida de la eficacia de la transfección de nanopartículas poliméricas se presenta. En este protocolo, poli (beta-amino-éster) s (PBAEs) se utilizan como polímeros de modelo y células humanas endoteliales retinianas (HRECs) se utilizan como moDel células humanas. Este protocolo puede ser fácilmente adaptado para evaluar cualquier nanopartícula polimérica y cualquier tipo de célula de interés en un formato de placa de múltiples pocillos.

La Figura 1 muestra una imagen de microscopía de fluorescencia de una muestra de una transfección con éxito de HRECs con el plásmido EGFP. La imagen de campo claro es útil para asegurar que las células mantienen su morfología habitual. Adicionalmente, ensayos de viabilidad celular, tales como MTS o ensayos similares, se puede utilizar para evaluar la toxicidad de las nanopartículas 7. La citometría de flujo, como se ha descrito, se puede utilizar para cuantificar la eficiencia de la ...

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Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Un protocolo para el análisis de nanopartículas de seguimiento (NTA) y de alto rendimiento de citometría de flujo para evaluar las nanopartículas poliméricas de suministro de genes se describe. NTA se utiliza para caracterizar la distribución del tamaño de partícula de nanopartículas y la distribución de partículas por plásmido. De alto rendimiento de la citometría de flujo permite una evaluación cuantitativa eficacia de la transfección de una biblioteca de biomateriales de suministro de genes.

La evaluación de la administración de genes nanopartículas poliméricas por nanopartículas de análisis de seguimiento y de alto rendimiento Citometría de Flujo

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Formulación de nanopartículas poliméricas mediante la técnica de dibloque Nanoprecipitation

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Investigación

Bioingeniería

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The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

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