Name: evaluation of polymeric gene delivery nanoparticles by nanoparticle tracking analysis and high-throughput flow cytometry
Uploaded: 2013-03-01T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry at JoVE.com

Författarna tackar TEDCO MSCRF (2009-MSCRFE-0098-00) och NIH R21CA152473 stöd.

1. Cellsådd <ol><li> Låt inte cellerna att växa till overconfluency. Använd tidig passage celler när transfektering primära celler. </li><li> Tjugofyra timmar före transfektion, Trypsinisera cellerna, räkna cellerna med användning av en hemocytometer, och späd cellsuspensionen med media för att uppnå den önskade celltätheten (celler / volym). Seed celler in tydlig vävnadskultur-behandlade flatbottnade 96-brunnars plattor med användning av en reservoar och pipetter flerkanaliga. Den valda densiteten bö...

<ol>
	<li>Putnam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymers+for+gene+delivery+across+length+scales.">Polymers for gene delivery across length scales.</a> Nature Materials. 5, 439-451 (2006).</li><li>Sheyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+cells+in+regenerative+medicine+and+tissue+engineering.">Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7297-7301 (1995).</li><li>Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rita+Schaffer+Lecture:+Nanoparticles+for+Intracellular+Nucleic+Acid+Delivery.">Rita Schaffer Lecture: Nanoparticles for Intracellular Nucleic Acid Delivery.</a> Ann. Biomed. Eng. 40, 1408-1418 (2011).</li><li>Lynn, D. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradable+poly(beta-amino+esters):+Synthesis,+characterization,+and+self-assembly+with+plasmid+DNA.">Degradable poly(beta-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA.</a> J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).</li><li>Sunshine, J. C., Peng, D. Y., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+transfection+with+polymeric+nanoparticles+are+dependent+on+polymer+end-group+structure,+but+largely+independent+of+nanoparticle+physical+and+chemical+properties.">Uptake and transfection with polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure, but largely independent of nanoparticle physical and chemical properties.</a> Mol. Pharm. , (2012).</li><li>Shmueli, R. B., Sunshine, J. C., Xu, Z., Duh, E. J., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+nanoparticles+specific+for+human+microvasculature+and+macrovasculature.">Gene delivery nanoparticles specific for human microvasculature and macrovasculature.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. , (2012).</li><li>Bhise, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+terminal+functionalization+and+molecular+weight+of+a+gene+delivery+polymer+and+transfection+efficacy+in+mammary+epithelial+2-D+cultures+and+3-D+organotypic+cultures.">The relationship between terminal functionalization and molecular weight of a gene delivery polymer and transfection efficacy in mammary epithelial 2-D cultures and 3-D organotypic cultures.</a> Biomaterials. 31, 8088-8096 (2010).</li><li>Tzeng, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+gene+delivery+nanoparticles+based+on+poly(beta-amino+esters)+for+treatment+of+glioblastoma.">Non-viral gene delivery nanoparticles based on poly(beta-amino esters) for treatment of glioblastoma.</a> Biomaterials. 32, 5402-5410 (2011).</li><li>Sunshine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule+End-Groups+of+Linear+Polymer+Determine+Cell-Type+Gene-Delivery+Efficacy.">Small-Molecule End-Groups of Linear Polymer Determine Cell-Type Gene-Delivery Efficacy.</a> Adv. Mater. 21, 4947 (2009).</li><li>Bhise, N. S., Shmueli, R. B., Gonzalez, J., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+quantifying+the+number+of+plasmids+encapsulated+by+polymer+nanoparticles.">A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles.</a> Small. 8, 367-373 (2012).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences.">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li><li>Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+intracellular+stability+and+unpacking+of+DNA+nanocomplexes+by+quantum+dots-FRET.">Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET.</a> Journal of Controlled Release: Official journal of the Controlled Release Society. 116, 83-89 (2006).</li><li>Kreiss, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+DNA+size+does+not+affect+the+physicochemical+properties+of+lipoplexes+but+modulates+gene+transfer+efficiency.">Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency.</a> Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).</li><li>Pitard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-sized+self-assembling+lamellar+complexes+between+plasmid+DNA+and+cationic+micelles+promote+gene+transfer.">Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14412-14417 (1997).</li><li>Collins, L., Kaszuba, M., Fabre, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+solution+of+(Lys)(16)-containing+bifunctional+synthetic+peptide/DNA+nanoparticles+for+gene+delivery.">Imaging in solution of (Lys)(16)-containing bifunctional synthetic peptide/DNA nanoparticles for gene delivery.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1672, 12-20 (2004).</li><li>Green, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+polymeric+vectors+for+gene+delivery+to+human+endothelial+cells.">Biodegradable polymeric vectors for gene delivery to human endothelial cells.</a> Bioconjug. Chem. 17, 1162-1169 (2006).</li></ol>

Protokollen ovan beskriver metoder för utvärdering av transfektion effekten av nanopartiklar formuleringar, liksom ett sätt att karakterisera partikelstorleken och DNA lastning av nanopartiklar. Antalet plasmider per partikel är en viktig parameter som kan hjälpa till att förutsäga effektiviteten av partikeln och kan också användas för bestämning dos. Nanopartiklar spårning analys kan utföras i en rad olika vattenhaltiga lösningar, såsom de som skiljer sig i saltkoncentration. Ofta denna karakterisering u...

Fastställandet av antalet plasmider komplexbundna per nanopartiklar är viktigt att utforma effektiva nanopartiklar baserade strategier gentillförsel, särskilt för samarbete leverans av flera plasmider i samma cell mål, ofta krävs i stamceller omprogrammering studier 12. Få metoder för att beräkna antalet plasmider som är förknippade med en enda nanopartikel har beskrivits, och varje metod har nackdelar i de tekniker som används för skattning 13-16. Quantum dot (QD) märkning i kombination med TEM har använts för att uppskatta plasmider per partikel i kitosan-baserade nanopartiklar. Skattning med denna QD teknik är komplicerat på grund av behovet att märka DNA, som kan förändra sina självorganisering egenskaper, möjligheten att inkapslade omärkt DNA inte direkt detekteras; potentiellt överlappande plasmider och QDs i 2D TEM-bilder av partiklar, och andra förenklande antaganden 13. Ett alternativt tillvägagångssätt som är enpplicable när beställda mikroområden finns i partiklarna har använts för att studera lipopolyamin-DNA-komplex via kryo-transmissionselektronmikroskopi (kryo-TEM), X-ray scattering, och dynamisk ljusspridning (DLS) 14,15. Tyvärr, material såsom de polymera nanopartiklar undersökta här är inte tillämpliga med denna metod. I en annan studie använde Collins et al ett flöde partikel teknik bildanalys för att studera (Lys) 16-innehållande peptid / DNA-komplex,. Kan dock deras metod endast utvärdera större, mikrometerstorlek partiklar 16. Därför utvecklade vi nyligen en ny och flexibel analys för att kvantifiera antalet plasmider per nanopartiklar 11.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Fosfatbuffrad saltlösning, 1x (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 10.010 </td><td></td></tr><tr><td> EGM-2 mV BulletKit </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Invitrogen </td><td> 25.300 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumacetatbuffert </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7899 </td><td> Späd till 25 mM i avjoniserat vatten </td></tr><tr><td> Dimetylsulfoxid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 276.855 </td><td></td></tr><tr><td> pEGFP DNA </td><td> Elim Biopharmaceuticals </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> DsRed DNA </td><td> Addgene </td><td> 21.718 </td><td></td></tr><tr><td> PEI, grenad </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 408.727 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> CellTiter 96 vattenhaltiga </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Material </td></tr><tr><td> Klar flatbottnad 96-brunnsplatta, steril </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1581.001 </td><td></td></tr><tr><td> Klar rundbottnad 96-brunns platta, steril </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1582.001 </td><td></td></tr><tr><td> 12-kanals Finnpipette </td><td> Thermo Scientific </td><td> NA </td><td> 5-50 och 50-300 ul </td></tr><tr><td> Fluorescensmikroskop </td><td> Zeiss </td><td> NA </td><td> Modell nummer: AX10 </td></tr><tr><td> C6 Accuri flödescytometer </td><td> BD Biosciences </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> HyperCyt fäste </td><td> Intellicyt </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> NS500</td><td> NanoSight </td><td> NA </td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of polymeric gene delivery nanoparticles by nanoparticle tracking analysis and high-throughput flow cytometry

Icke-viral gen leverans med polymera nanopartiklar har blivit en attraktiv metod för genterapi för att behandla genetiska sjukdomar 1 och som en teknik för regenerativ medicin 2. Till skillnad från virus, som har betydande säkerhetsfrågor, kan polymera nanopartiklar utformas för att vara icke-toxiska, icke-immunogena, icke-mutagena, lättare att syntetisera, kemiskt mångsidig, kan bära större nukleinsyra last och biologiskt nedbrytbart och / eller miljömässigt mottaglig. Katjoniska polymerer själv montera med negativt laddad DNA via elektrostatisk växelverkan att bilda komplex av storleksordningen 100 nm, som vanligen benämns polymera nanopartiklar. Exempel på biomaterial som används för att bilda nanonivå polykatjoniska nanopartiklar gentillförsel inkluderar polylysin, polyphosphoesters, poly (amidoaminer) s och polyetylenimin (PEI), som är en icke-nedbrytbar off-the-shelf katjoniska polymeren som vanligen används för nukleinsyra leverans 1,3. Poly (beta-amino-ester) s (PBAEs) är en nyare klass av katjoniska polymerer 4 som är hydrolytiskt nedbrytbara 5,6 och har visat sig vara effektiva vid genleverans till svåra att transfektera celltyper såsom humana retinala endotelceller (HRECs) 7, mus mammära epitelceller 8, mänskliga hjärnan cancerceller 9 och makrovaskulära (mänsklig navelven, HUVEC) endotelceller 10. Ett nytt protokoll för att karakterisera polymera nanopartiklar använder nanopartiklar spårning analys (NTA) beskrivs. I detta tillvägagångssätt, är både partikelstorleksfördelningen och fördelningen av antalet plasmider per partikel erhållen 11. Dessutom är en hög genomströmning 96-brunnars platta transfektionsanalysen för snabb screening av transfektion effekten av polymera nanopartiklar presenteras. I detta protokoll är poly (beta-aminoester) s (PBAEs) som används som modell polymerer och mänskliga retinala endotelceller (HRECs) används som model humana celler. Detta protokoll kan enkelt anpassas för att utvärdera eventuella polymera nanopartiklar och vilken celltyp som helst av intresse i en platta med flera brunnar formatet.

Figur 1 visar en fluorescensmikroskopi bild av ett exempel på en lyckad transfektion av HRECs med EGFP-plasmiden. Den brightfield bilden är till hjälp för att säkerställa att cellerna bibehåller sin vanliga morfologi. Dessutom kan cellernas viabilitet analyser, såsom MTS eller liknande analyser, kan användas för att bedöma toxiciteten nanopartiklar 7. Flödescytometri, såsom beskrivits, kan användas för att kvantifiera transfektionseffektiviteten. När du använder HyperCyt fler...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry at JoVE.com

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Ett protokoll för nanopartiklar spårning analys (NTA) och hög genomströmning flödescytometri för att utvärdera polymera nanopartiklar gentillförsel beskrivs. NTA används för att karakterisera nanopartiklar partikelstorleksfördelningen och plasmiden per partikelfördelningen. Hög genomströmning flödescytometri möjliggör kvantitativ utvärdering transfektion effektivitet för ett bibliotek av biomaterial gentillförsel.

Utvärdering av polymera Gene Delivery nanopartiklar genom nanopartikel Tracking Analys och hög kapacitet flödescytometri

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Formulering av Diblock polymera nanopartiklar genom Nanoprecipitation Teknik

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Polymer Microarrays för hög genomströmning Upptäckt av Biomaterial

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Kombinatorisk syntes av och hög kapacitet Protein Release från Polymer Film och bibliotek nanopartiklar

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Analysera Cellulär internalisering av Nanopartiklar och bakterier genom att multispektralt Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Hög kapacitet Syntes av kolhydrater och Funktionalisering av polyanhydrid Nanopartiklar

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

Polymera mikronålmatris Fabrication genom fotolitografi

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Tillverkning och Drug Delivery Tillämpningar av Silk Nanopartiklar

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Isolering av primära murin retinala Ganglion-celler (RGC) genom flödescytometri

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Användning av High-Throughput automatiserat Microbioreactor System för produktion av modell IgG1 i CHO-celler

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

Flash NanoPrecipitation för inkapsling av hydrofoba och hydrofil föreningar i polymera nanopartiklar

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...