Name: evaluation of polymeric gene delivery nanoparticles by nanoparticle tracking analysis and high-throughput flow cytometry
Uploaded: 2013-03-01T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry at JoVE.com

Yazarlar destek için TEDCO MSCRF (2009-MSCRFE-0098-00) ve NIH R21CA152473 ederim.

1. Hücre Seeding <ol><li> Hücreleri overconfluency büyümeye izin vermeyin. Birincil hücreler transfekte erken ne zaman geçiş hücreleri kullanın. </li><li> Transfeksiyon öncesi Yirmi dört saat, hücrelerin Trypsinize bir hemositometre kullanılarak hücrelerin sayısı, ve arzu edilen hücre yoğunluğu (hücre / hacim) elde etmek için ortam ile hücre süspansiyonu seyreltin. Net doku içine Tohum hücrelerinin bir rezervuar ve çok kanallı pipetler kullanarak düz alt 96-kuyucuğu kültür-tedavi. Seçil...

<ol>
	<li>Putnam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymers+for+gene+delivery+across+length+scales.">Polymers for gene delivery across length scales.</a> Nature Materials. 5, 439-451 (2006).</li><li>Sheyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+cells+in+regenerative+medicine+and+tissue+engineering.">Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7297-7301 (1995).</li><li>Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rita+Schaffer+Lecture:+Nanoparticles+for+Intracellular+Nucleic+Acid+Delivery.">Rita Schaffer Lecture: Nanoparticles for Intracellular Nucleic Acid Delivery.</a> Ann. Biomed. Eng. 40, 1408-1418 (2011).</li><li>Lynn, D. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradable+poly(beta-amino+esters):+Synthesis,+characterization,+and+self-assembly+with+plasmid+DNA.">Degradable poly(beta-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA.</a> J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).</li><li>Sunshine, J. C., Peng, D. Y., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+transfection+with+polymeric+nanoparticles+are+dependent+on+polymer+end-group+structure,+but+largely+independent+of+nanoparticle+physical+and+chemical+properties.">Uptake and transfection with polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure, but largely independent of nanoparticle physical and chemical properties.</a> Mol. Pharm. , (2012).</li><li>Shmueli, R. B., Sunshine, J. C., Xu, Z., Duh, E. J., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+nanoparticles+specific+for+human+microvasculature+and+macrovasculature.">Gene delivery nanoparticles specific for human microvasculature and macrovasculature.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. , (2012).</li><li>Bhise, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+terminal+functionalization+and+molecular+weight+of+a+gene+delivery+polymer+and+transfection+efficacy+in+mammary+epithelial+2-D+cultures+and+3-D+organotypic+cultures.">The relationship between terminal functionalization and molecular weight of a gene delivery polymer and transfection efficacy in mammary epithelial 2-D cultures and 3-D organotypic cultures.</a> Biomaterials. 31, 8088-8096 (2010).</li><li>Tzeng, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+gene+delivery+nanoparticles+based+on+poly(beta-amino+esters)+for+treatment+of+glioblastoma.">Non-viral gene delivery nanoparticles based on poly(beta-amino esters) for treatment of glioblastoma.</a> Biomaterials. 32, 5402-5410 (2011).</li><li>Sunshine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule+End-Groups+of+Linear+Polymer+Determine+Cell-Type+Gene-Delivery+Efficacy.">Small-Molecule End-Groups of Linear Polymer Determine Cell-Type Gene-Delivery Efficacy.</a> Adv. Mater. 21, 4947 (2009).</li><li>Bhise, N. S., Shmueli, R. B., Gonzalez, J., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+quantifying+the+number+of+plasmids+encapsulated+by+polymer+nanoparticles.">A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles.</a> Small. 8, 367-373 (2012).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences.">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li><li>Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+intracellular+stability+and+unpacking+of+DNA+nanocomplexes+by+quantum+dots-FRET.">Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET.</a> Journal of Controlled Release: Official journal of the Controlled Release Society. 116, 83-89 (2006).</li><li>Kreiss, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+DNA+size+does+not+affect+the+physicochemical+properties+of+lipoplexes+but+modulates+gene+transfer+efficiency.">Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency.</a> Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).</li><li>Pitard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-sized+self-assembling+lamellar+complexes+between+plasmid+DNA+and+cationic+micelles+promote+gene+transfer.">Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14412-14417 (1997).</li><li>Collins, L., Kaszuba, M., Fabre, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+solution+of+(Lys)(16)-containing+bifunctional+synthetic+peptide/DNA+nanoparticles+for+gene+delivery.">Imaging in solution of (Lys)(16)-containing bifunctional synthetic peptide/DNA nanoparticles for gene delivery.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1672, 12-20 (2004).</li><li>Green, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+polymeric+vectors+for+gene+delivery+to+human+endothelial+cells.">Biodegradable polymeric vectors for gene delivery to human endothelial cells.</a> Bioconjug. Chem. 17, 1162-1169 (2006).</li></ol>

Yukarıdaki protokol nanoparçacık formülasyonların transfeksiyon etkinliği gibi parçacık boyutu ve nanoparçacıkların DNA yükleme karakterize etmek için bir yöntem değerlendirme yöntemleri açıklanmaktadır. Parçacık başına plazmit sayısı parçacık etkisini tahmin yardımcı olabilir önemli bir parametre olan ve aynı zamanda doz tayini için kullanılabilir. Nanopartikül izleme analizi, tuz konsantrasyonunun farklı olanlar gibi çeşitli sulu çözeltiler, bir dizi içinde gerçekleştirilebili...

Nanoparçacık başına komplekslenmiş plazmid sayısının belirlenmesi, özellikle de aynı hedef hücre için birden çok plazmit ortak dağıtımı için etkili nanoparçacık tabanlı bir gen aktarım stratejilere tasarlamak için önemli olan, sıklıkta çalışmaları 12 yeniden programlanması kök hücre gereklidir. Tek bir nanoparçacık ile ilişkili plazmid sayısını hesaplamak için birkaç yaklaşım tarif edilmiştir ve her bir yaklaşım tahmin 13-16 için kullanılan teknikler de dezavantajları vardır edilmiştir. TEM ile birlikte Kuantum nokta (QD) etiketleme kitosan tabanlı nanopartiküller parçacık başına plazmidler tahmin etmek için kullanılır olmuştur. Kapsüllü etiketsiz DNA doğrudan tespit edilememesi olasılığı;; potansiyel örtüşen plazmidler ve parçacıkların 2D TEM görüntülerde QDS; Bu QD teknik ile Kestirimi nedeniyle kendinden montaj özelliklerini değiştirebilir DNA, etiketlemek için ihtiyaç karmaşık ve Diğer basitleştirici kabuller 13. Bir alternatif bir yaklaşımpplicable sipariş microdomains parçacıklar mevcut olduğunda kriyo-transmisyon elektron mikroskobu (kriyo-TEM), X-ışını saçılması ve dinamik ışık saçılımı (DLS) 14,15 aracılığıyla Lipopolyamine-DNA kompleksleri incelemek için kullanılır olmuştur. Ne yazık ki, bu tür araştırmak burada polimer nanopartikülleri gibi malzemeler bu yöntem ile uygulanabilir değildir. . Ancak, kendi yöntemi sadece büyük, mikron boyutlu parçacıklar 16 değerlendirebilir; başka bir çalışmada, Collins ve ark çalışmak için bir akış parçacık görüntü analizi tekniği (Lys) 16-içeren peptid / DNA kompleksleri kullanılır. Böylece, son zamanlarda nanoparçacık 11 başına plazmit sayısı ölçmek için bir roman ve esnek analiz geliştirilmiştir.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reaktif </td></tr><tr><td> Fosfat, 1x (PBS) Tamponlu Salin </td><td> Invitrogen </td><td> 10010 </td><td></td></tr><tr><td> EGM-2mV BulletKit </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsin </td><td> Invitrogen </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum asetat tampon </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7899 </td><td> Deiyonize su 25mM için seyreltin </td></tr><tr><td> Dimetil sülfoksit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 276855 </td><td></td></tr><tr><td> pEGFP DNA </td><td> Elim Biyofarmasötikler </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> DsRed DNA </td><td> Addgene </td><td> 21718 </td><td></td></tr><tr><td> PEI, dallı </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 408727 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> CellTiter 96 sulu One </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Malzemeler </td></tr><tr><td> Şeffaf düz dipli 96-plaka, steril </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1581.001 </td><td></td></tr><tr><td> Açık bir yuvarlak tabanlı 96-kuyulu plaka, steril </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1582.001 </td><td></td></tr><tr><td> 12 kanallı Finnpipette </td><td> Thermo Scientific </td><td> NA </td><td> 5-50 ve 50-300 ul </td></tr><tr><td> Floresan Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> NA </td><td> Model numarası: AX10 </td></tr><tr><td> C6 Accuri flowsitometri </td><td> BD Biosciences </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> HyperCyt eki </td><td> Intellicyt </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> NS500</td><td> Nanosight </td><td> NA </td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of polymeric gene delivery nanoparticles by nanoparticle tracking analysis and high-throughput flow cytometry

Polimerik nano partiküller kullanarak Sigara viral gen teslimat genetik hastalıklar 1. tedavisinde gen tedavisi için cazip bir yaklaşım olarak ve rejeneratif tıp 2 için bir teknoloji olarak ortaya çıkmıştır. Önemli güvenlik sorunları var virüsler, aksine, polimerik nano partiküller büyük nükleik asit kargo ve biyolojik olarak parçalanabilen ve / veya çevreye duyarlı taşıma kapasitesine sahip, kimyasal olarak çok yönlü, sentezlemek için non-toksik, non-immünojen olmayan mutajenik, daha kolay olması için dizayn edilebilir. Katyonik polimerler yaygın polimerik nano partiküller olarak adlandırılır 100 nm sırasına komplekslerini oluşturmak için elektrostatik etkileşim yoluyla negatif yüklü DNA ile kendi kendine monte. Nano ölçekli polikatyonik gen aktarımı nanopartikülleri oluşturmak için kullanılan biyomateryaller örnekleri arasında bir non-parçalanabilir off-the-shelf bir polilisin, polyphosphoesters, poli (amidoamines) s ve polietilenimin (PEI), yaygın olarak bulunur nükleik asit aktarımı ile 1,3 kullanılan katyonik polimer. Poli (beta-Aminoester) s (PBAEs), 5,6 hidrolitik olarak parçalanabilir olan ve bu tür insan retina endotel hücreleri (HRECs) 7 gibi sert-transfekte hücre tipleri için gen aktarımının etkili olduğu gösterilmiş olan katyonik polimerler 4 yeni bir sınıfıdır fare meme epitel hücreleri 8, insan beyninin kanser hücreleri 9 ve 10 makrovasküler (insan umbilikal ven, HUVEC&#39;lere) endotel hücreleri. Nanoparçacık izleme analizi (NTA) kullanılarak polimer nanopartikülleri karakterize etmek için yeni bir protokol tarif edilmektedir. Bu yaklaşıma göre, partikül büyüklük dağılımı ve parçacık başına plazmid sayısı dağılım hem de 11 elde edilir. Buna ek olarak, polimer nanopartikülleri ile transfeksiyon etkinliğinin hızlı taranması için olan bir yüksek verimli 96-plaka transfeksiyon deneyinde sunulmuştur. Bu protokol, poli (beta-amino ester) s (PBAEs) model polimerler ve insan retina endotel hücreleri (HRECs) olarak kullanılır mo olarak kullanılmaktadırdel insan hücreleri. Bu protokol, kolayca herhangi bir polimerik nanoparçacık ve bir multi-plaka biçiminde ilgi herhangi bir hücre tipi değerlendirmek için adapte edilebilir.

Şekil 1, plazmid EGFP HRECs ile başarılı bir şekilde aktarılmasının bir örnek olarak, flöresanlı bir mikroskop görüntüsü gösterilmektedir. Aydınlık görüntü hücreleri normal morfoloji korumalarını sağlamak için yardımcı olur. Ayrıca, bu tür MTS ya da benzer deneyler gibi hücre canlılığı deneyleri, nanoparçacık toksisite 7 değerlendirmek için de kullanılabilir. Akış sitometrisi, tarif edildiği gibi, transfeksiyon etkinliği ölçmek için kullanılabil...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry at JoVE.com

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Nanoparçacık izleme analizi (NTA) ve polimerik gen teslimat nanopartiküller değerlendirmek için high-throughput Akım sitometri için bir protokol tanımlanmıştır. NTA nanoparçacık parçacık büyüklüğü dağılımı ve plazmid başına parçacık dağılımını karakterize etmek için kullanılmaktadır. Yüksek throughput flow sitometri gen teslimat biyomalzemelerin bir kütüphane için nicel transfeksiyon etkinliği değerlendirilmesini sağlar.

Polimerik Gen Taşıyıcı Değerlendirilmesi Nanoparçacık İzleme Analizi ve Yüksek throughput Flow Sitometri tarafından Nanopartiküller

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Nanoprecipitation Tekniği Diblock Polimerik Nanopartiküller formülasyonu

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Biyomalzemelerin Yüksek Verimli Discovery için Polimer Mikroarray&#39;ler

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Kombinatorik Sentezi ve Polimer Film ve Nanoparçacık Kütüphaneler gelen Yüksek throughput Protein Yayın

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Çoklu-spektral Görüntüleme Akım Sitometri tarafından Nanopartiküller ve Bakterilerin Hücresel İçselleştirilmesi Analizi

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Polianhidrid Nanopartiküller Yüksek throughput Karbonhidrat sentezi ve işlevsel

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

Fotolitografiyle polimerik Microneedle Dizi Fabrikasyon

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

İpek Nanopartiküller imalatı ve İlaç Dağıtım Uygulamaları

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Akış Sitometresi ile Primer Sıçan Retinalı Ganglion Hücrelerinin (RGC) İzolasyonu

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Yüksek üretilen iş kullanımı otomatik Microbioreactor sistemi modeli Igg1 CHO hücrelerdeki imalatı için

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

Hidrofobik ve hidrofilik bileşikler polimer nano tanecikleri Kapsülleme için NanoPrecipitation flash

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...