Name: biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2013-03-30T14:00:00
Duration: 16 min 7 s
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Nous tenons à remercier Michael Kacergis d&#39;assistance technique et Lianfeng Wu pour les discussions et la lecture du manuscrit. Ce travail a été soutenu par une bourse de développement de carrière du NIH / NIDDK (K08DK087941 à AAS), une NIH / NIDDK bourse de formation (5T32DK007028 ECP), la Fondation Médicale Ellison New Scholar Award de vieillissement (au AAS), et le H Charles . Capot enfant Health Foundation Bourse de recherche (à l&#39;AAS).

1. Préparation des rectangulaire Amp / Tet (A / T) plaques de gélose LB et NGM IPTG Plaques ARNi A Plaques / T doit être préparé 1-4 semaines avant de l&#39;utiliser et stockés dans l&#39;obscurité à 4 ° C. <ol><li> Pour 1 L de médias ajouter 1 L d&#39;eau déminéralisée, 32 g de gélose LB, 1,5 ml de NaOH 2 M et 2 g de gélose Bacto. Autoclaver 40 min sur le cycle de liquide. Après refroidissement à 60 ° C, ajouter 3 ml de tetracycline et 0,5 ml d&#39;ampicilline. Verser 45 ml de milieu dans chaque assiette. </li></ol> Préparer les plaques 96 puits ARNi 3 jours jusqu&#39;à 2 semaines à l&#39;avance. <ol start="2"><li> Verser 25 plaques à 96 puits ARNi, préparer 1 L de la croissance des nématodes médias (NGM): 1 L d&#39;eau déminéralisée, 3 g de NaCl, 17 g d&#39;agarose, et 2,5 g bactopeptone. Autoclave cycle liquide à 121 ° C pendant 40 min avec un agitateur. Laisser refroidir en remuant sur un ensemble plaque chauffante à 60 ° C. </li><li> Une fois refroidi à 60 ° C, ajouter les solutions mères suivantes: 1 ml 1 M MgSO 4, 1 ml à 5 mg / ml de cholestérol, 25 ml 1 M de KH 2 </sub&gt; PO 4 (pH 6,0), 1 ml 1 M CaCl 2, 1 ml à 200 mg / ml de carbénicilline et 5 ml de 1 M IPTG (voir tableau Matériaux pour les recettes). </li><li> Distribuer 150 l de RNAi médias dans chaque puits d&#39;un fond plat de 96 puits en utilisant une pipette multicanaux électronique. Évitez les bulles d&#39;air. Conservez les supports dans un récipient en acier inoxydable stérile immergé dans un bain d&#39;eau à 60 ° C pendant la distribution. </li><li> Gardez ARNi plaques niveau jusqu&#39;à agarose se solidifie. Les plaques peuvent être versés jusqu&#39;à 2 semaines à l&#39;avance et stocké à 4 ° C. </li></ol> Jour 1 2. Cachet de bibliothèque Plaques surgelés sur Rectangulaire Amp / Tet (A / T) plaques de gélose LB <ol><li> A réchauffer plaques / T à la température ambiante, de les maintenir dans l&#39;obscurité. </li><li> Transfert plaques à 96 puits bibliothèque ARNi de -80 ° C à la glace sèche. Ouvrez la plaque d&#39;aluminium scellée à proximité d&#39;un bec Bunsen. </li><li> Stériliser un réplicateur de 96-broches en immergeant les repères de série (10 s chacun) dans l&#39;eau de Javel à 10%, H 2 O déminéralisée, et E 70%Toh suivi d&#39;un passage broches à travers une flamme. Répétez EtOH et l&#39;étape de la flamme. </li><li> Appliquer réplicateur de gelée de 96 puits stock de glycérol ARNi, en s&#39;assurant que chaque broche contact avec la surface de chaque puits. </li><li> Cachet sur une plaque / T, dessinant un petit cercle avec chaque broche sans nuire surface de la gélose. </li><li> Plaques Re-joint et de la bibliothèque de retour à -80 ° C. Incuber les plaques estampillées A / T à 37 ° C pendant la nuit à la croissance bactérienne. </li></ol> Jour 2 3. Cultivez clones bactériens ARNi Nuit à puits profonds blocs <ol><li> Retirer des plaques A / T de 37 ° C et confirment la croissance bactérienne. </li><li> Remplir chaque puits d&#39;un bloc de 96 puits en puits profond avec 1,5 ml de LB avec 200 pg / ml de carbénicilline. </li><li> Stériliser à 96 broches réplicateur (voir l&#39;étape 2.3). </li><li> Appliquer réplicateur vers le haut de la plaque A / T, fabrication d&#39;épingles sûr prendre contact avec chaque clone bactérien ARNi. Soulevez réplicateur et les broches plonger dans le bloc de puits profonds. Swirl, et retirer lentement, faisant CErtains de ne pas contaminer les puits adjacents. </li><li> Sceller bloc avec breathe-facile film. Incuber une nuit à 37 ° C sous agitation (950 rpm dans MT Infors Microtiteron shaker II, préféré, ou 250 rpm dans un lancer de 25 mm incubateur agitateur). </li></ol> Jour 3 4. Les clones bactériens semences ARNi sur des plaques 96 puits ARNi NGM <ol><li> Retirer des plaques 96 puits ARNi de 4 ° C et réchauffer à température ambiante. </li><li> Retirer puits profonds blocs et centrifuger 10 min à 4000 x g. </li><li> Rapidement inverser les blocs dans évier de médias et de timbre inversée sur une serviette en papier pour éliminer l&#39;excès des médias. </li><li> Sous une hotte à flux laminaire, ajouter 40 ul de LB avec 200 pg / ml de carbénicilline à chaque puits et le joint avec le film stérile. </li><li> Retour blocs à température ambiante bactérienne agitateur pendant 10 minutes pour remettre en suspension des pastilles, granulés ou manuellement resuspendre par pipetage soigneux. </li><li> Dans la hotte à flux laminaire, retirez la pellicule de transfert stérile et les bactéries de profondesblocs ainsi sur des plaques à 96 puits ARNi. Ajouter 40 ul de bactéries remises en suspension à des lignes «A» et «H», et 35 pi de toutes les autres lignes. Plus le liquide est ajouté aux puits de bord de la plaque de 96 puits ARNi pour empêcher le surséchage et la fissuration de l&#39;agarose. </li><li> Laisser les plaques à découvert à sécher dans la hotte pour 4-6 heures, inspecter régulièrement de la sécheresse. Bactéries sèches apparaissent clairement, non trouble. Couvrir et incuber inverser plaques à température ambiante pendant une nuit. </li></ol> 5. Préparer une population synchrone de Worms Deux plaques de 10 cm remplis de beaucoup de vers gravides sont utilisés pour la préparation des œufs pour tous les 6 plaques de 96 puits ARNi. Assurez-vous que les vers ne sont pas morts de faim depuis au moins deux générations (7 jours). <ol><li> Préparer une population synchrone de L1 comme décrit précédemment 20. Pour 20 ml d&#39;eau de Javel, eau de Javel utiliser 4 ml, 1 ml de NaOH (10 M), 5 ml d&#39;eau désionisée H 2 O et 10 ml de tampon M9. </li><li> Synchroniser vers la nuit dans 10 ml M9 dans un 15 ml stérileTube en polypropylène avec une rotation à 20 ° C. </li></ol> Jour 4 6. Ajouter à Worms Plaques ARNi <ol><li> Centrifuger préparations d&#39;œufs à 3000 xg pendant 1 min. Aspirer le surnageant, de rester loin de la pastille de L1 nouveau-nés. Remettre en suspension dans 5 ml de tampon M9 avec 0,0005% de Triton X-100. Ajout de la petite quantité de détergent empêche les vers de coller à la pipette et n&#39;a aucun effet sur la coloration des graisses. </li><li> Compter les vers sous un microscope. Si nécessaire, ajuster la concentration à 10-15 vers par microlitre. </li><li> Dans la hotte à flux laminaire, pour chaque plaque de 96 puits à ensemencer, ajouter 75 ul de vers remises en suspension dans chaque puits d&#39;une rangée d&#39;un bloc d&#39;essai peu profonds puits. En utilisant une pipette multicanaux manuelle, ajouter 50-75 vers dans 5 pl dans chaque puits des plaques à 96 puits ARNi. </li><li> Laisser les plaques sécher dans la hotte pendant 30 à 60 min. Une fois sec, sous un microscope, les vers doivent apparaître à ramper, pas volée. </li><li> Cultivez les vers sur des plaques ARNià 20 ° C pendant 64 h ~. </li></ol> Jour 7 7. Fixer et Stain Worms en rouge Nil <ol><li> Retirer les plaques de l&#39;incubateur ARNi. Examiner au microscope et enregistrer affamés ou volée (humide) puits à exclure de l&#39;analyse plus loin, que ces conditions affectent la masse grasse. </li><li> En utilisant une pipette électronique répétition, ajoutez 150 ul de PBS avec 0,01% de triton X-100 à chaque puits d&#39;une plaque de RNAi. Avec un manuel multi-canal pipette, mélanger et liquide de transfert de vers à la ligne correspondante dans une plaque de 96 puits profond PCR. Éviter de perturber l&#39;agar-agar. Répétez l&#39;opération pour un total de 300 ul dans du PBS vers par puits. </li><li> Lorsque les plaques quatre ont été transférés, centrifuger les plaques à 500 rpm pendant 1 min. </li><li> Aspirer le surnageant à l&#39;aide d&#39;un aspirateur à vide 96-broches, en laissant environ 25 pl de liquide et vis sans fin culot au fond du puits. </li><li> Ajouter 150 ul de 40% d&#39;isopropanol à chaque puits pour arrêter animaux. Assurez-vous que pipette est sur une vitesse suffisamment élevée pour mélanger vergranulés avec 40% d&#39;isopropanol. Incuber à température ambiante pendant 3 min. </li><li> Plaques à centrifuger à découvert à 500 rpm pendant 1 min. </li><li> Aspirer le surnageant à l&#39;aide d&#39;un aspirateur 96-broches, soit manuellement, en laissant seulement 25% d&#39;isopropanol 40 ul + culot à vis sans fin au fond du puits. </li><li> Pour chaque puits, ajouter 150 ul de solution de coloration rouge du Nil préparée immédiatement avant utilisation: 6 pl du Nil solution de rouge de 0,5 mg / ml dans de l&#39;acétone pour 1 ml de 40% d&#39;isopropanol. </li><li> Plaque d&#39;étanchéité avec un film adhésif non stérile et la tache dans l&#39;obscurité pendant au moins 2 heures. </li></ol> 8. Worms lavage et de l&#39;image sur un microscope à haut débit <ol><li> Centrifuger à 500 rpm pendant 1 min et aspirer tous, mais 25 ul de colorant rouge du Nil. </li><li> Ajouter 150 ul de PBS avec 0,01% de triton X-100 à chaque puits et les entreposer dans l&#39;obscurité pendant au moins 30 min. </li><li> Centrifuger à 500 rpm pendant 1 min. </li><li> À l&#39;aide d&#39;une pipette 12-canal, les animaux aspirés à partir du fond de chaque puits avec 2 x 7 pi miniaccidents vasculaires cérébraux et passer sur une lame de verre de 96 puits en téflon imprimé. Soigneusement, sans suppression des vers, retirer 9,5 l de PBS dans chaque puits de la lame. Si votre lame de verre ne s&#39;insère pas directement dans votre montage microscope, une coutume support coulissant en aluminium usiné doit être utilisé pour monter vers. </li><li> Tiroir de recouvrement abaissez lentement sur la glissière de 96 puits. Cette étape peut prendre un peu de pratique pour éviter les bulles ou traverser des vers dans les autres puits. Coins sécurisés avec adhésivité. </li><li> Diapositive d&#39;image dans le champ lumineux et de la fluorescence avec un filtre GFP / FITC fixé sur un microscope automatisé. Les agents de photoblanchiment de signaux lipidiques facilement de sorte qu&#39;il devrait être imagé de manière systématique dans tous les puits, et non pas manuellement, comme photoblanchiment conduira à des différences artificielles entre les puits. Pour plus de détails sur l&#39;analyse, s&#39;il vous plaît voir résultats représentatifs et discussion. </li></ol> 9. Détermination des lipides biochimiques par extraction en phase solide (SPE) et chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC / MS) <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Pour la validation des taux de lipides sur la base du Nil fluorescence rouge, chromatographie en phase gazeuse suivie d&#39;une analyse par spectrométrie de masse (GC / MS) peut être effectuée sur esters méthyliques d&#39;acides gras (FAME) dérivés de triacylglycérols (TAG) et des phospholipides (PL) de granulés à vis sans fin. Étapes impliquant organiques doit être effectuée sous une hotte. Des précautions doivent être prises pour que les lipides sont conservés sous azote abri de la lumière pendant un stockage prolongé ou étapes d&#39;incubation car ils sont très vulnérables à l&#39;oxydation. Worm granulés de 2,500-5,000 animaux synchrones sont utilisés comme entrée, préparé exactement comme ci-dessus, sauf que les animaux sont cultivés sur des plaques de 10 cm ARNi. <ol><li> Laver 2,500-5,000 vers de chaque plaque 10 cm avec 10 ml de tampon M9 dans un tube de 15 ml conique en polypropylène. Vers Pellet à 500 xg pendant une minute, et laver à granulés de nouveau avec 10 ml de tampon M9. Animaux pellets à 500 x g. Aspirer volume de 250 ul laissant total, et soit gel de l&#39;azote liquide et conserver à -80 ° C sous atmosphère d&#39;azote for un traitement ultérieur ou passer directement. </li><li> Le culot à vis sans fin peut être pris directement à l&#39;étape 9.3 si la masse de triglycérides doit être normalisée par rapport à la masse 8,13,21 phospholipide. Toutefois, si le chercheur désire normalisation de la teneur en protéines ou l&#39;ADN contenu, le culot à vis sans fin doivent être soumis à une sonication sur la plus haute intensité dans un bain sonique pendant 10 min, 30 sec sur, 30 sec éteint, à 4 ° C. Si la normalisation protéines ou d&#39;ADN est désiré, retirer une aliquote de 5 ul et déterminer la concentration totale en protéines à l&#39;aide d&#39;un réactif de Bradford ou la teneur en ADN similaire ou totale après purification sur colonne à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre UV. </li><li> Ajouter des vers à 1,5 ml 02h01 chloroforme: méthanol dans un tube en verre borosilicate filetée. Tous les transferts de solvants organiques devrait être fait en utilisant des pipettes en verre. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un wiretrol 50 ul pipette, ajouter 25 nM norme phospholipides dans 50 pi et 16,7 nM norme triglycérides dans 50 pl. Les normes devraient être dissoute in 2:1 chloroforme: méthanol, plafonné bien,et conservées sous azote l&#39;abri de la lumière dans un congélateur à -80 ° C pour éviter l&#39;oxydation. </li><li> Casquette avec bouchon phénolique et vortex. Extrait pendant 1 heure à température ambiante, vortex toutes les 15 min. </li><li> Centrifuger à 1000 rpm pendant 5 min. Transfert phase organique inférieure sans carcasses d&#39;un tube de culture borosilicate. </li><li> Ajouter 0,3 ml de NaCl 0,9%, vortex et centrifuger à 1000 tours par minute pendant 5 minutes. </li><li> Transfert couche inférieure organique dans un tube de culture borosilicate frais, en veillant à ne pas céder sur toute la phase aqueuse. </li><li> Phase organique à sec sous azote. Pour commencer l&#39;extraction en phase solide (SPE) remettre en suspension lipidique séchée dans 1 ml de chloroforme. Sinon, pour la séparation et l&#39;analyse détaillée des différentes classes de lipides, y compris les classes de phospholipides, les glycolipides, les sphingolipides, les diacylglycérols, triacylglycérols, acides gras libres, et les esters de cholestérol, chromatographie sur couche mince que la première fois par le laboratoire Watts en C. elegans 22 peut être utilisé à la place du SPE. Les lipides peuvent aussi be séparés par HPLC et les fractions analysées par GCMS. Des méthodes sophistiquées de l&#39;ensemble du lipidome profilage par liquid-chromatography/MS (LCMS) peut également être utilisé 23-26. </li><li> Assemblez colonne de silice SPE sur le collecteur SPE. Pré-colonne d&#39;équilibrage avec 3 ml de chloroforme. Laissez le solvant s&#39;écouler par gravité. </li><li> Charger l&#39;échantillon sur la colonne SPE lipidique, la collecte de l&#39;écoulement à travers un tube taraudé dans borosilicate comme partie de la première fraction (fraction TAG). Lipides les plus neutres viendra par dans ce premier 1 ml accréditives. Ajouter 3 ml de chloroforme pleinement éluer la fraction TAG, la collecte accréditives dans le tube fraction TAG. </li><li> Retirez et plafonner le tube première collection, et la remplacer par un tube de prélèvement propre. Éluer glycosphingolipides avec 5 ml d&#39;acétone 9:1 méthanol. Nous n&#39;avons pas l&#39;habitude d&#39;analyser la composition en acides gras de cette fraction, cependant, il peut contenir des informations précieuses et peuvent être enregistrées pour la préparation des esters méthyliques et les bases sphingoïdes gratuitement pour une analyse plus approfondie en utilisantprocédures spécialisées distinctes de celles pour TAG et PL comme décrit précédemment 27. </li><li> Remplacer le tube de collecte Glycosphingolipide avec un deuxième tube de collecte filetée borosilicate. Éluer phospholipides avec 3 ml de méthanol (fraction PL). </li><li> Les fractions peuvent être conservés à -80 ° C en ce moment plafonné bien sous atmosphère d&#39;azote. Sec purifié lipides sous azote. Pour accélérer le séchage, dans un bloc de chauffage à sec à 33 ° C. Ne jamais stocker des lipides sous forme séchée, car ils sont particulièrement sensibles à l&#39;oxydation à l&#39;état sec. </li><li> Fractions lipidiques Resuspendre séchées dans 2 ml 2% de H 2 SO 4 dans le méthanol par vortex et incuber plafonné bien la nuit dans un bain d&#39;eau à 55 ° C pour créer EMAG. Des précautions doivent être prises pour obtenir absolument pas d&#39;eau dans la réaction FAME que cela va grandement inhiber la dérivatisation des lipides. Nous avons trouvé dérivatisation plus efficace par une nuit d&#39;incubation et de la littérature suggère l&#39;oxydation des lipides moins se produit à des températures plus basses During FAME préparation 28. Une méthode alternative et plus rapide est d&#39;utiliser 2 ml 2,5% de H 2 SO 4 dans le méthanol et dériver pendant une heure à 70 ou 80 ° C 21,22,29. </li><li> Le lendemain matin, retirer du bain et laissez-le refroidir. Ajouter 1,5 ml de H 2 O (pour stopper la réaction), puis 0,3 ml d&#39;hexane (pour extraire les EMAG) pour chaque TAG et la fraction PL. Agiter vigoureusement et centrifuger à 1000 rpm pendant 5 min. </li><li> Très soigneusement enlever seulement la couche supérieure d&#39;hexane en utilisant un standard pipette ou une pipette Pasteur. Verser dans le tube échantillonneur automatique. Assurez-vous de ne pas inclure méthanol acidifié car cela détruirait la colonne GC et MSD. </li><li> Cap et des échantillons de charge sur GC / MS. L&#39;échantillon est transféré dans un flacon hexane à micro-insert Agilent coiffé d&#39;un bouchon à vis en PTFE PTFE du silicone. Il est transféré à la 6890/5973N Agilent modèle équipé d&#39;un GCMS Supelcowax-10 (24 079) de 30 mètres, 250 colonne de silice fondue micron capillaire. Un microlitre est injecté into entrée splitless fixé à 250 ° C et 13,33 PSI ultrapure L&#39;hélium est utilisé un gaz porteur. La course protocole est le suivant: à un niveau constant de 1 ml par minute: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Étape </td><td> Instruction </td><td> Température objectif </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Maintenir 2 min </td><td> 150 ° C </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Rampe de 10 ° C par minute </td><td> 200 ° C </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Tenez 4 min </td><td> 200 ° C </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Rampe de 5 ° C par minute </td><td> 240 ° C </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Tenir 3 min </td><td> 240 ° C </td></tr><tr><td> 6 </td><td> Rampe de 10 ° C par minute </td><td> 270 ° C </td></tr><tr><td> 7 </td><td> Maintenez 5 min </td><td> 270 ° C </td></tr></tbody></table> Un délai de 3 min solvant est utilisé à la DDM pour minimiser l&#39;usure du filament. Par la suite, entre les masses 50 et 550 daltons sont détectés avec la MS ensemble quadruple à 150 ° C et la source ms fixée à 230 ° C, avec une température thermique auxiliaire de 270 ° C.

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Les auteurs n&#39;ont pas de conflits d&#39;intérêts à déclarer.

Le protocole présenté permet rapide, le dépistage à grande échelle des taux de lipides dans C. elegans, qui peuvent être facilement adaptés aux écrans à haut débit. Contrairement aux méthodes utilisées précédemment, qui impliquent une étape de fixation longue dans du paraformaldéhyde suivie par plusieurs cycles gel-dégel 8,10, notre protocole nécessite un simple 3-min de fixation dans l&#39;isopropanol. Nous avons constaté que par coloration C. elegans dans 40% d&#39;isopropanol, elles deviennent librement perméable à Nil rouge, sans l&#39;utilisation d&#39;autres étapes de congélation-décongélation ou de fixation. En outre, comme le Nil rouge fluorescent de manière sélective dans des compartiments hydrophobes dans le spectre vert 18,19,31, aucune décoloration est nécessaire. Au total, les animaux peuvent être prises à partir de plaques ARNi à des animaux d&#39;image colorés et prêts à en un peu plus de 2,5 heures. Ce procédé peut être réalisé relativement peu de frais et avec une grande reproductibilité. La méthode ne dépend pas de la capacité de C. elegans à l&#39;absorption ou de concentréle colorant, et donc n&#39;a pas les mêmes limites que les méthodes d&#39;alimentation à base utilisant des colorants vitaux. Compte tenu de la reproductibilité et la précision des mesures, la méthode est appropriée pour dépister un grand nombre de gènes par RNAi inactivations. Si la quantification des taux de lipides est souhaitée sur la base de fixateur coloration au rouge Nil, nous recommandons l&#39;utilisation de 4-6 biologique reproduit avec les contrôles appropriés et les essais statistique appliquée. Il est probable que de nombreux gènes inactivation conduisant à de petits animaux (en raison de clones d&#39;ARNi causant un retard du développement ou arrêté) allait sortir de l&#39;écran pour les régulateurs de graisse, indépendamment de tout lien avec le métabolisme des graisses. Bien que le programme d&#39;analyse d&#39;images, nous avons utilisé les comptes pour les vers de différentes tailles en normalisant l&#39;intensité de fluorescence de la zone ver, les chercheurs peuvent aussi envisager de comparer les niveaux de coloration de matières grasses de petits animaux à des animaux de type sauvage de même stade de développement. Dans lecas de petits animaux ou de développement arrêtés à la masse apparente faible teneur en gras, nous suggérons que seule modalité ne suffit à démontrer le métabolisme lipidique altéré. Plusieurs expériences de suivi, y compris SPE-SMGC, pourraient être nécessaires pour déterminer la fonction des lipides réglementaire de ces gènes. Pour régulateur métabolique connue FASN-1, SPE-SMGC analyse comparée du développement d&#39;animaux appariés N2 L2 contrôle était nécessaire pour confirmer le phénotype apparent faible en gras trouvé par rapport aux animaux témoins adultes. Alors que la graisse du Nil rouge coloration indiqué plus faibles niveaux de graisse par rapport au témoin adulte ARNi, par rapport à la scène appariés animaux L2 contrôle ARNi, aucune différence apparente n&#39;a été observée. En conséquence, l&#39;utilisation d&#39;une deuxième méthode, c&#39;est à dire la quantification biochimique du rapport TAG / PL a été nécessaire pour déterminer que FASN-1 est un véritable régulateur de la masse grasse, comme FASN-1 ARNi est biochimiquement distincte de l&#39;étape appariés animaux L2 ARNi contrôle. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Alors que nous vous présentons l&#39;imagerie et le traitement d&#39;une plateforme à haut débit, un microscope vertical classique peut facilement être utilisé pour capturer des images à partir des vers montés sur plots 20 d&#39;agarose ou sur format classique de téflon imprimé 8 à 12 lames de microscope et . La seule limitation est que la fluorescence verte de gouttelettes lipidiques colorées avec photoblanchiment rouges du Nil rapidement, systématiques, des conditions d&#39;exposition uniformes doivent être utilisés pour assurer la comparabilité entre les images. Nous constatons que d&#39;un microscope entièrement automatisé avec des conditions uniformes d&#39;acquisition d&#39;image qui fonctionne le mieux à cet effet. L&#39;une des grandes forces de ce protocole est que une fois les images recueillies, elles peuvent être enregistrées pour l&#39;avenir de ré-analyse. Les mêmes images peuvent être utilisées pour déterminer la taille du corps, en plus de matières grasses. En outre, comme les programmes informatiques deviennent plus avancés, il ya la perspective de l&#39;analyse seul ver, générant des résultats statistiquement significatifsà partir d&#39;un seul puits. Ainsi, notre méthode qui utilise la microscopie à haut débit a quelques avantages par rapport aux méthodes écran publiés qui utilisent un Biosort Copas pour quantifier des signaux fluorescents 32,33. Toutefois, les méthodologies sont certainement gratuit. Précise, la détermination biochimique de la teneur en lipides par SPE et GC / MS confirme la coloration rouge du Nil des grands magasins de graisse dans C. elegans. Bien que la quantification absolue obtenue à partir de fixateur coloration au rouge Nil et la détermination des lipides biochimiques souvent ne correspondent pas parfaitement, les deux méthodes donnent hautement reproductibles, des résultats statistiquement significatifs qui sont d&#39;accord qualitatif. En outre, cette méthode peut être adaptée pour répondre aux besoins spécifiques des chercheurs individuels qui peuvent nécessiter une analyse plus approfondie des catégories distinctes de glycosphingolipides, les phospholipides, des triglycérides ou présents dans des échantillons différents. Il est à noter que d&#39;autres groupes ont utilisé la technologie d&#39;autres than SPE pour séparer les classes de lipides avant GC / MS 22. Chromatographie sur couche mince (CCM) et la chromatographie liquide haute pression (HPLC) a des avantages sur SPE en ce qu&#39;ils pourraient être en mesure de mieux séparer les lipides neutres distincts (par exemple, TAG, diacylglycérols, acides gras libres et les esters de cholestérol) à partir de lipides polaires (phosphatidylcholine, phosphatidyléthanolamine) et des glycols sphingolipides. Nous choisissons SPE, car il nécessite un minimum de matière première (2,500-5,000 vers), il met l&#39;accent sur ​​les grands magasins énergétiques à long terme, les étiquettes, qui constituent l&#39;essentiel de la fraction lipidique neutre 4, et est rapide, ne nécessitant pas d&#39;équipement spécialisé ou des plaques. Il convient de souligner que sur la base de mélanges standard, SPE se sépare complètement de TAG PL, et il est hautement reproductible et fiable (voir figure 5A). Alors que la quantification et l&#39;analyse des esters méthyliques d&#39;acides gras nécessite un GC / MS, cet équipement est généralement disponible, et si ce n&#39;est pas localement, les échantillons peuventêtre produite comme ci-dessus et stocké à -80 ° C sous atmosphère d&#39;azote jusqu&#39;à ce que l&#39;analyse par un collaborateur ou commerciale GC / MS de service est agencée. La sortie du SMGC contient des données à haute résolution sur chaque acide gras des lipides au sein de chaque espèce. Ceci permet la détermination des différences de détail entre les échantillons comparés. A titre d&#39;exemple, l&#39;enquêteur peut déterminer si les niveaux de certains acides gras ont été modifiés en abondance de manière plus significative que les autres daf-2, lpd-3-1 ou FASN ARNi contre la lutte antivectorielle. Cet outil extrêmement puissant peut donc fournir des informations détaillées sur les espèces lipidiques sont modifiés en abondance toute manipulation expérimentale. Pour notre analyse, nous avons le plus souvent à normaliser la masse TAG à la messe PL. Tandis que les protéines ou de l&#39;ADN pourrait aussi être utilisée pour normaliser la masse lipidique après la détermination d&#39;une aliquote de ver soniqué granulés, on constate que ces méthodes font l&#39;objet d&#39;introduit une erreur humaine lors de toutes les étapes de pipetage et de récupération de l&#39;échantillon de chaque extraction. C&#39;est pour cette raison que nous avons choisi d&#39;utiliser à la place la masse PL que notre facteur de normalisation. Normes artificielles introduites au début du protocole (tritridecanoin pour TAG, le 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycéro-3-phospho-(1&#39;-rac-glycérol) pour PL) sont portés par l&#39;ensemble des étapes de l&#39;extraction en phase solide et préparation FAME, et de garantir une récupération quantitative et représentative à la fois de TAG et les fractions PL. La même garantie ne peut être faite si les enquêteurs utilisent des protéines ou de l&#39;ADN de normaliser la masse TAG. Nous croyons PL être la mesure la plus robuste permettant de comparer les niveaux de TAG pour tous les échantillons, comme cela a été montré précédemment que PL ne minutieusement modifiées par le même stimulus effectuer des changements importants dans les niveaux de masse TAG, par exemple, la famine prolongée ou accrue exercice 34 - 36. PL sont supposés jouer un rôle structurel, assurant la fluidité des membranes cellulaires et intégrationgrité et rôles de signalisation plutôt que comme stockage d&#39;énergie 37-39. Dans nos mains, le rapport TAG / PL correspond le mieux à ce qui est obtenu par coloration lipidique fixateur à base de rouge Nil, et est d&#39;accord avec celle trouvée par d&#39;autres groupes 21. Une autre stratégie est utilisée par le laboratoire Watts, où le pourcentage de lipides TAG est calculé par rapport lipides totaux 9,22,29. L&#39;utilisation des non-natifs types de TAG et PL norme garantit qu&#39;aucune des acides gras natifs sont inclus dans le calcul de normalisation. Le choix de la longueur de la chaîne est purement basé sur la nécessité de ces normes pour ne pas interférer avec les spectres de masse des indigènes acides gras. Nous avons découvert que les acides gras de 13:00 et 17:0 servir au mieux à cette fin. Il est possible, compte tenu des propriétés chimiques différentes d&#39;acides gras à chaîne courte, que nos normes d&#39;acides gras artificiels pourraient ne pas être représentatifs de la récupération de tous les acides gras à chaîne longue ou des chaînes avec diffindices de saturation erentes. Ainsi, il est possible que lors de la SPE ou SMGC nous pourrions voir des différences dans l&#39;efficacité de la purification ou la détection entre les lipides de différentes longueurs de chaîne. Sur la base de cela et l&#39;ionisation différente de différents acides gras dans le SMGC, il n&#39;est pas possible de faire une déclaration sur l&#39;abondance absolue de tout acide gras donné. Par conséquent, nous ne comparer entre les échantillons dans une abondance d&#39;expériences uniques de n&#39;importe quel acide gras donné. Si l&#39;on voulait absolument quantifier un acide gras, une façon d&#39;y parvenir serait d&#39;exécuter un échantillon préparé comme ci-dessus additionnées d&#39;une quantité connue d&#39;un marquage isotopique stable version du 13 C de ladite ou similaire d&#39;acides gras, de sorte qu&#39;il pourrait être distinguer sur la base de la masse de l&#39;ion parent dans le TMS, par exemple. Étant donné que nous ne faisons que comparer des quantités relatives des classes de lipides ou tout autre acide gras donné, notre TAG 13h00 et 17h00 normes PL servir cet objectif de manière adéquate, à un minimum de coût, deassurer la récupération adéquat et représentatif de chaque classe de lipides. Jusqu&#39;à ce point, il ya eu un manque de consensus quant à l&#39;interprétation de certains résultats obtenus par diverses méthodes, et à ce que les méthodes en vigueur devrait être. Globalement, il convient de noter qu&#39;aucune méthode en vase clos est idéal pour étudier le métabolisme des graisses en C. elegans. Cependant, en utilisant dépistages multiples et les modalités de validation, on peut arriver à une confiance dans les données obtenues sur les gènes régulateurs de lipides. Ainsi, nous avons l&#39;intention de notre protocole de servir de référence pour les travaux futurs dans le domaine de la C. elegans recherche graisses.

Conservation des voies métaboliques entre les humains et le nématode Caenorhabditis elegans en fait un organisme modèle puissant pour l&#39;étude de l&#39;obésité. Alors que C. elegans n&#39;ont pas adipocytes dédiés au stockage de graisse comme chez les mammifères, ils ne triglycérides dans 1 boutique gouttelettes lipidiques et possèdent la plupart des organismes de réglementation mêmes de stockage des graisses et 2,3 la consommation d&#39;énergie. Pour doser les niveaux de graisse dans C. elegans, plusieurs méthodes ont été proposées avec différents niveaux de facilité et de succès. L&#39;utilisation commune d&#39;une fois fluorescents, des colorants vitaux 4-7 a été récemment remis en question, et ces réactifs se sont avérées colorer un compartiment distinct de l&#39;entrepôt principal corps gras de C. elegans 1,8-11. Fixateur à base de colorants non fluorescents, tels que le Soudan noir et huile rouge O, alors réussi à mettre en évidence des gouttelettes lipidiques dans le ver 12-14, n&#39;ont pas une aussi grande plage dynamique pour la quantification comme fluorescent de pigments 8,13,15. En outre, les méthodes actuelles de fixation des colorants fluorescentes et non fluorescentes sont longs et impliquent de multiples étapes de congélation-décongélation et / ou l&#39;utilisation de produits chimiques toxiques 1,9,10. L&#39;utilisation d&#39;analogues de lipides spécifiques BODIPY marquées ont été rapportés pour mettre en évidence des gouttelettes lipidiques dans l&#39;alimentation des vers vivants à court terme d&#39;étiquetage 15. Cependant cela repose sur l&#39;absorption du colorant et est donc biaisée par C. manipulation elegans et le métabolisme des acides gras BODIPY analogues. Une alternative mis en place pour les lipides coloration colorants est sans étiquette, anti-Stokes cohérente de diffusion Raman (CARS) ou diffusion Raman stimulée (SRS) microscopie, qui tirent parti des propriétés caractéristiques vibratoires des molécules lipidiques pour visualiser les réserves de graisse 10,16, 17. Cependant, coûteux équipement spécialisé est nécessaire pour cette méthode, et le débit est faible, au mieux. Pour répondre à un besoin pour rapide, analyse évolutivelyse des réserves de lipides neutres dans C. elegans recherche métabolique, nous introduisons une nouvelle méthode hautement reproductible de fixateur à base de coloration des lipides du Nil rouge. Propriétés spectrales et physico-chimiques de la teinture rouge Nil lipophile induire un changement de couleur jaune-or-spectrale dans son excitation-émission de crête, permettant de fluorescence dans le spectre d&#39;émission de vert que lorsque dans un environnement riche en lipides, mais pas dans les environnements les plus polaires 18 , 19. Ainsi des gouttelettes lipidiques peuvent être détectés après coloration simple par l&#39;utilisation d&#39;une protéine fluorescente verte (GFP) de filtre fixé à la microscopie par fluorescence. La facilité et l&#39;accessibilité de cette technique le rendent idéal pour les écrans à haut débit. Nous démontrons également un appareil couplé, méthode rigoureuse pour la détermination biochimique des triglycérides et des phospholipides par extraction en phase solide et chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse. Bilan lipidique biochimique en corrélation avec la détermination microscopique du Nil à base de rouge de C. elegans fala masse t et devrait être utilisé comme une confirmation des constatations faites avec détermination lipidique microscopique.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> 96-pin réplicateur </td><td> Nunc </td><td> 250520 </td><td></td></tr><tr><td> Agar LB </td><td> US Biologicals </td><td> L1500 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 16500500 </td><td></td></tr><tr><td> Pipettes mécaniques </td><td> Biohit M Ligne </td><td> M10, M100, M300 </td><td></td></tr><tr><td> Pipette électronique </td><td> Biohit la ligne E </td><td> E1200 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M KH 2 PO 4 </td><td> Sigma </td><td> P0662 </td><td> pH 6,0 stérilisé à l&#39;autoclave </td></tr><tr><td> 1 M MgSO 4 </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td> Stérilisé par Autoclaving </td></tr><tr><td> 1 M CaCl 2 </td><td> Sigma </td><td> C2661 </td><td> Stérilisés par autoclavage </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S5886 </td><td></td></tr><tr><td> 5 mg / ml Cholestérol </td><td> Sigma </td><td> C8667 </td><td> Dans de l&#39;éthanol à 100% </td></tr><tr><td> 200 mg / ml de carbénicilline </td><td> US Biologicals </td><td> C1100 </td><td> Stérilisée par filtration 0,2 μ </td></tr><tr><td> 1 M IPTG </td><td> US Biologicals </td><td> I8500 </td><td> Stérilisée par filtration 0,2 μ </td></tr><tr><td> 100 mg / ml ampicilline </td><td></td><td></td><td> Stérilisée par filtration 0,2 μ </td></tr><tr><td> 5 mg / ml tétracycline </td><td></td><td></td><td> Dans de l&#39;éthanol à 100% </td></tr><tr><td> Bacto Agar </td><td> BD </td><td> 214040 </td><td></td></tr><tr><td> Plaques à 96 puits TC </td><td> BD-Falcsur </td><td> 353072 </td><td> Pour bien 96-RNAi </td></tr><tr><td> Plaques rectangulaires A / T </td><td> Thermo Scientific </td><td> 242811 </td><td> Pour estampage ARNi </td></tr><tr><td> Médias LB </td><td> US Biologicals </td><td> L1530 </td><td> Préparé selon les instructions du fabricant </td></tr><tr><td> De 96 puits profonds blocs puits d&#39;essai </td><td> Corning </td><td> Costar 3960 </td><td> Rectangulaire bloc d&#39;essai à fond en V </td></tr><tr><td> De 96 puits peu profonds Bloquer Essai Eh bien </td><td> Corning </td><td> Costar 3956 </td><td> Round bloc d&#39;essai à fond en V </td></tr><tr><td> Film d&#39;étanchéité stérile </td><td> VWR </td><td> 89134-432 </td><td></td></tr><tr><td> Film d&#39;étanchéité en aluminium </td><td> Corning </td><td> Costar 6570 </td><td> Bande d&#39;étanchéité doigt de gant pour plaques à 96 puits </td></tr><tr><td> M9 tampon </td><td> Voir espoir et al 20. </td&gt; <td></td><td> Voir la recette ci-dessous </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0407 </td><td></td></tr><tr><td> Rouge Nil </td><td> Invitrogen </td><td> N-1142 </td><td></td></tr><tr><td> Isopropanol </td><td> Pêcheur </td><td> BP2632-4 </td><td></td></tr><tr><td> 96-pin aspirateur </td><td> VP scientifique </td><td> VP177A-1 </td><td></td></tr><tr><td> De 96 puits en téflon Microscope Slides masqués </td><td> Thermo Scientific </td><td> Coutume </td><td> Pouvez également commander Trevigen de 96 puits Cometslide </td></tr><tr><td> De 96 puits d&#39;or-Seal Coverslides </td><td> Thermo Scientific </td><td> Coutume </td><td> Pouvez également utiliser seconde de 96 puits Cometslide </td></tr><tr><td> Puits profond plaque PCR </td><td> VWR </td><td> 89049-178 </td><td></td></tr><tr><td> Film adhésif non stérile </td><td> VWR </td><td> 60941-070 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope à haut débit </td><td> Leica </td><td> DM6000 entièrement automatisé avec le stade préalable de 96 puits </td><td> Avec Chroma 49002 GFP ensemble filtre et objectif 2x </td></tr><tr><td> Sonicator Bath </td><td> Diagenode </td><td> Bioruptor XL </td><td></td></tr><tr><td> Chloroforme </td><td> Sigma </td><td> 366927-4L </td><td></td></tr><tr><td> Méthanol </td><td> Pêcheur </td><td> Optima F456-4 </td><td></td></tr><tr><td> Norme phospholipides </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 830456P </td><td> 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycéro-3-phospho-(1&#39;-rac-glycérol) </td></tr><tr><td> Norme de triglycérides </td><td> NuChek Prep </td><td> T-135 </td><td> tritridecanoin </td></tr><tr><td> Wiretrol 50 ul Pipet </td><td> Pêcheur </td><td> 21 à 176-3A </td><td> Drummond Scientfic </td></tr><tr><td>Acétone </td><td> Sigma </td><td> 320110-4L </td><td></td></tr><tr><td> Acide sulfurique </td><td> Pêcheur </td><td> A300-500 </td><td></td></tr><tr><td> Hexane </td><td> Pêcheur </td><td> Optima H306-1 </td><td></td></tr><tr><td> Colonne de silice SPE </td><td> Thermo Scientific </td><td> 60108-317 </td><td> Hypersep SI, 100 mg lit de résine </td></tr><tr><td> Collecteur Chromatographie en phase solide </td><td> Sigma </td><td> 57265 </td><td> Supelco Visiprep 24-DL </td></tr><tr><td> Pipettes borosilicate </td><td> Pêcheur </td><td> 13-678-27F </td><td> Taille 10 ml </td></tr><tr><td> Pipettes Pasteur borosilicate </td><td> Pêcheur </td><td> 13-678-8B </td><td></td></tr><tr><td> Tubes de culture borosilicate </td><td> Pêcheur </td><td> 14-961-27 </td><td></td></tr><tr><td> Tubes filetés borosilicaté </td><td> VWR </td><td> 14235-460</td><td> Une capacité de 8 ml </td></tr><tr><td> Casquettes phénoliques pour Tubes de culture </td><td> Pêcheur </td><td> 14-823-211 </td><td></td></tr><tr><td> GC / MS flacons échantillonneur automatique </td><td> Agilent </td><td> 5188-6592 </td><td></td></tr><tr><td> Bouchons pour flacons échantillonneur automatique </td><td> Agilent </td><td> 5185-5861 </td><td></td></tr><tr><td> GC / MS </td><td> Agilent </td><td> 6890/5973 MSD </td><td> Équipé d&#39;une colonne Supelcowax-10 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> La croissance des nématodes médias (NGM): pour 25 plaques de 96 puits ARNi, préparer 1 L de NGM: <table border="1"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Montant </td></tr><tr><td> De l&#39;eau déminéralisée </td><td> 1 L </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 3 g </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> 17 g </td></tr><tr><td> Bacto peptone </td><td> 2,5 g </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave cycle liquide 121 ° C pendant 40 min avec un agitateur. Laisser refroidir à 60 ° C en agitant sur un ensemble plaque chauffante à 60 ° C. Puis ajoutez la ligne suivante: </td></tr><tr><td> 1 M MgSO 4 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 5 mg / ml de cholestérol </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 1 M KH 2 PO 4 (pH 6,0) </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td> 1 M CaCl 2 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 200 mg / ml de carbénicilline </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 1 M IPTG </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Répartir dans des assiettes ARNi de 96 puits. Entreposer à 4 ° C jusqu&#39;à leur utilisation, jusqu&#39;à 2 semaines. </td></tr></tbody></table> Rectangulaires ampicilline / tétracycline plaques d&#39;agar LB (A / T): pour 20 plaques A / T, préparer 1 L de médias: <table border="1"><tbody><tr><td&gt; Réactif </td><td> Montant </td></tr><tr><td> De l&#39;eau déminéralisée </td><td> 1 L </td></tr><tr><td> LB agar (US Biologicals) </td><td> 32 g </td></tr><tr><td> 2 M NaOH </td><td> 1,5 ml </td></tr><tr><td> Agar Bacto </td><td> 2,5 g </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave cycle liquide 121 ° C pendant 40 min avec un agitateur. Laisser refroidir à 60 ° C en agitant sur un ensemble plaque chauffante à 60 ° C. Puis ajoutez la ligne suivante: </td></tr><tr><td> Tétracycline </td><td> 3 ml </td></tr><tr><td> 100 mg / ml ampicilline </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Verser 45 ml dans chaque assiette. Conserver dans l&#39;obscurité à 4 ° C jusqu&#39;à leur utilisation, jusqu&#39;à 4 semaines. </td></tr></tbody></table> Milieu LB croissance bactérienne: pour 4 L, suffisants pour la culture et la remise en suspension 25 96 puits blocs Mix 62 g de poudre LB (US biologiqueals), 4 L d&#39;eau distillée et 4,8 ml de NaOH 2 M. Autoclaver dans 1 L ou 0,5 L aliquotes, le cycle de liquide, 40 min. Peut être stocké jusqu&#39;à 1 an dans des bouteilles hermétiques à température ambiante. Jeter si nuageux. 100 mg / ml ampicilline Délayer 5 g d&#39;ampicilline en poudre et de l&#39;eau déminéralisée à un volume total de 50 ml. Stériliser par filtration 0,2 μ, passer en aliquotes de 1 ml et congeler à -20 ° C jusqu&#39;à leur utilisation. 5 mg / ml tétracycline Ajouter 1,25 g de poudre de tétracycline à 250 ml d&#39;éthanol à 100%. Bien mélanger jusqu&#39;à dissolution complète et conserver à -20 ° C dans un récipient étanche à la lumière. 200 mg / ml de carbénicilline Mélanger 10 g de poudre de carbénicilline et de l&#39;eau désionisée jusqu&#39;à un volume total de 50 ml. Stériliser par filtration 0,2 μ, passer en aliquotes de 1 ml et congeler à -20 ° C jusqu&#39;à leur utilisation. 5 mg / mlCholestérol Ajouter 1,25 g de cholestérol pour 250 ml d&#39;éthanol à 100%. Bien mélanger et conserver à 4 ° C pendant 6 mois. 1 M MgSO 4 Dissoudre 120,37 g MgSO 4 dans 800 ml d&#39;eau déminéralisée. Amener le volume final à 1 L. Autoclave 40 Cycle liquide min et conserver à température ambiante. 1 M CaCl 2 Dissoudre 110,98 g de CaCl2 dans 800 ml d&#39;eau déminéralisée. Amener le volume final à 1 L. Autoclave 40 Cycle liquide min et conserver à température ambiante. 1 M KH 2 PO 4 à pH 6,0 Dissoudre 136,09 g KH 2 PO 4 dans 800 ml d&#39;eau désionisée. pH à 6,0 et porter le volume final à 1 L. Autoclave 40 Cycle liquide min et conserver à température ambiante. M9 Tampon: pour 1 L-nous routinely faire lots 8-10 L Dissoudre 3 g de KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, 1 ml 1 M MgSO 4 dans 900 ml. Amener le volume final à 1 Aliquoter L. 100-500 bouteilles en ml et autoclave 40 min sur le cycle liquide et conserver à température ambiante. NaOH 10 N Dissoudre 400 g de NaOH dans 800 ml d&#39;eau déminéralisée, laisser refroidir et porter à un volume final de 1 Magasin L. en tubes de 50 ml à la température ambiante. 1 M IPTG Ajouter 23,81 g IPTG à l&#39;eau désionisée et amener le volume total à 100 ml. Stériliser par filtration 0,2 μ, passer en aliquotes de 1 ml et congeler à -20 ° C jusqu&#39;à leur utilisation. Préparation oeufs Bleach / NaOH Solution: 20 ml suffit pour une préparation d&#39;œufs Ajouter 4 ml eau de javel, 1 ml de NaOH 10 N, 5 ml H 2 O et 10 mlTampon M9 dans un tube de 50 ml conique en polypropylène. Faire immédiatement avant utilisation. Solution du Nil rouge stock Ajouter 50 ml d&#39;acétone à 100% pour 25 mg poudre rouge Nil. Bien mélanger et conserver à température ambiante étanche à la lumière contenant parafilmed. Peuvent être stockés pendant des mois dans cette manière. Solution du Nil coloration rouge: pour 500 ml, suffisant pour la coloration 30 x plaques à 96 puits Ajouter 3 ml du Nil solution de rouge de 500 ml à 40% v / v d&#39;isopropanol. Stocker à température ambiante dans une bouteille de verre gainé de papier. Préparer immédiatement avant l&#39;utilisation. Norme phospholipides Pesant 7,6 mg de phospholipides norme, le 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycéro-3-phospho-(1&#39;-rac-glycérol), dans un récipient en verre. Dissoudre dans 20 ml 02h01 chloroforme: méthanol (25 nanomoles par 50 pi). Garder couvert de papier d&#39;aluminium jusqu&#39;à utilisation.Standard peut également être conservé à -80 ° C dans un flacon en verre hermétique avec bouchon phénolique pendant 1 an. Norme de triglycérides Peser 6,8 mg norme triglycérides, tritridecanoin, dans un bécher. Dissoudre dans 30 ml 02h01 chloroforme: méthanol (16,7 nanomoles par 50 pi). Garder couvert de papier d&#39;aluminium jusqu&#39;à utilisation. Standard peut également être conservé à -80 ° C dans un flacon en verre hermétique avec bouchon phénolique pendant 1 an. </td></tr></tbody></table>

biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in caenorhabditis elegans

Le nématode C. elegans est devenue un modèle important pour l&#39;étude des voies génétiques conservées régulation du métabolisme des graisses en ce qui concerne l&#39;obésité humaine et ses pathologies associées. Plusieurs méthodologies précédentes développés pour la visualisation de C. elegans riches en triglycérides réserves de graisse se sont avérées erronées, mettant en évidence les compartiments cellulaires autres que les gouttelettes lipidiques. D&#39;autres méthodes nécessitent des équipements spécialisés, prennent beaucoup de temps, ou de produire des résultats incohérents. Nous introduisons une rapide, reproductible, fixateur méthode basée sur la coloration rouge du Nil pour la détection précise et rapide des gouttelettes lipidiques neutres en C. elegans. Une étape de fixation court dans 40% d&#39;isopropanol rend totalement perméables aux animaux Nil rouge, qui est ensuite utilisé pour colorer les animaux. Propriétés spectrales de ce colorant lipophile lui permettre d&#39;être fortement et sélectivement dans le spectre de fluorescence jaune-vert que lorsque dans un environnement riche en lipides, mais pas plus demilieux polaires. Ainsi, les gouttelettes lipidiques peuvent être visualisées sur un microscope à fluorescence équipé d&#39;une capacité GFP imagerie simple, après seulement une étape du Nil coloration rouge brève dans l&#39;isopropanol. La vitesse, l&#39;abordabilité et la reproductibilité de ce protocole font une solution idéale pour les écrans à haut débit. Nous démontrons également une méthode jumelé pour la détermination biochimique des triglycérides et des phospholipides par chromatographie en phase gazeuse spectrométrie de masse. Ce protocole plus rigoureux devrait être utilisé comme une confirmation des résultats obtenus à partir de la détermination du Nil rouge lipidique microscopique. Nous prévoyons que ces techniques vont devenir de nouveaux standards dans le domaine de la C. elegans recherche métabolique.

Un exemple d&#39;une plaque imagée qui a été prise par le workflow coloration graisse est illustré à la figure 1. Des contrôles spécifiques pour les graisses (daf-2 récepteur de l&#39;insuline ARNi), faible en gras (lpd-3 protéine nécessaire à granules de stockage de lipides dans le tube digestif ARNi), graisse de petite et basse (FASN-1 synthase des acides gras ARNi), et le vecteur vide ( contrôle) montrent les variations d&#39;intensité de fluorescence en fonction des niveaux de graisse des animaux, ainsi que les montants correspondants lipides déterminées par analyse GC / MS (Figure 2). Notez que inactivations gènes conduisant à de développement arrêtés, petits animaux semblent souvent avoir de la graisse beaucoup plus faible que les animaux témoins adultes, indépendamment de tout lien avec le métabolisme des graisses (figure 3). Des analyses secondaires, y compris l&#39;analyse de coloration et la biochimie des lipides avec SPE-GCMS des animaux témoins de type sauvage d&#39;un stade similaire de développement doit être fait pour assurer la validité despetite ou de développement arrêtés réponses positives. Dans le cas de FASN-1 ARNi (figure 2), l&#39;arrestation des animaux soit dans la L2 ou L3 stade larvaire, et présente des taches grasses inférieure de contrôle pour adultes ARNi, mais même dans l&#39;abondance de L2-L3 animaux étage de contrôle (ARNi pour cent de graisse tache des adultes de contrôle ARNi: 49,9 ± 4,5% pour FASN-1 ARNi et 20,2 ± 2,1% pour le contrôle L2 ARNi, et 64,7 ± 1,3 pour L3 contrôle ARNi). Sinon, l&#39;analyse biochimique a indiqué une baisse TAG / PL rapport que le stade L2 correspond animaux témoins N2 (TAG / PL: 22,5 ± 2,9 pour les FASN-1 ARNi et 46,1 ± 3,4 pour le stade assortie ARNi contrôle, P ≤ 0,05). Ainsi, dans ce cas, il peut être confirmé par une analyse biochimique qui FASN-1 joue un rôle dans le stockage des lipides plutôt que d&#39;une réduction spécifique du stade de la masse grasse. L&#39;analyse de suivi de vers imagés repose en grande partie sur une plate-forme de calcul telles que Profiler cellulaire à l&#39;aidel&#39;WormToolbox 30. Pour les plus petits nombres d&#39;images, une plate-forme accessible au public l&#39;image d&#39;analyse tels que ImageJ, disponible gratuitement sur le NIH, peuvent être utilisés. Pour notre analyse, uniques scripts Matlab ont été utilisés d&#39;abord d&#39;identifier le bien, et par la suite à exclure puits vides ou ceux avec des bulles, et de distinguer les petits débris de vers. Contrôle de la qualité manuelle était nécessaire pour les images battant pavillon d&#39;exclusion pour les raisons mentionnées ci-dessus. Nous avons constaté empiriquement que l&#39;intensité du 90e centile de pixels à vis sans fin à travers un puits, normalisée à travers une zone de ver bien, à condition cohérente métrique de intensité de la coloration à toutes les étapes du développement de ver (figure 3). L&#39;intégration totale de la masse grasse sur la zone du ver, au contraire, aurait tendance à marquer de petits vers lumineux avec de grandes équivalente vers sombres. Parce que notre méthode ne permet pas d&#39;intégrer signal fluorescent totale sur la zone du ver, en prenant un percentile intensité, changements dans la taille ver en soi ne pas faire det biais de l&#39;intensité mesurée. Au lieu de cela, les différences dans la distribution d&#39;intensité de pixels sont mesurées. Cependant, en dépit de cela, des différences marquées sont visibles dans la coloration distribution d&#39;intensité de pixels entre les animaux des différents stades de développement, il est donc important d&#39;étudier l&#39;effet de l&#39;ARNi à n&#39;importe quel gène contre les animaux d&#39;un stade comparable de développement (figure 3). Variabilité moyenne entre les répétitions est indiqué dans la figure 4 indique une haute reproductibilité de la méthode de coloration des graisses. Noter que la force de la méthode dépend fortement de l&#39;obtention d&#39;images de qualité pour chaque plaque, dans des conditions d&#39;éclairage uniforme, en utilisant des temps d&#39;exposition identiques, et avec un minimum de bulles, des débris ou des vers de croisement dans les autres puits. SPE a été réalisée sur la pré-mélangé, purifié normes afin de déterminer la mesure dans laquelle TAG peut être séparé de PL (figure 5A). Dans cette analyse, nous avons atteint un s 100%a séparation de TAG et PL, a indiqué que l&#39;absence totale de 17h00 acides gras dérivés de PL dans l&#39;échantillon TAG et une absence complète correspondante de 13h00 acides gras dérivés de TAG dans l&#39;échantillon PL (figure 5A). Ainsi, SPE est très efficace pour la séparation des classes de lipides. Cette analyse ne signifie pas que toutes les balises de différentes longueurs de chaîne équivalente sera purifié par SPE et détecté par GCMS avec une efficacité similaire. Il assure que seulement TAG et les lipides PL au total sont complètement séparés les uns des autres. Un échantillon GC-MS trace des animaux de type sauvage N2 prises par extraction en phase solide et une préparation FAME est représenté sur la figure 5B. À la fois pour TAG et PL, pics peuvent être identifiées sur la base du temps de rétention des ions parents et fille et sur le spectre de masse, et la surface totale sous les pics identifiés normalisés à la zone des normes internes respectives. Pour déterminer la quantité normalisée de TAG, la zonesous tous les pics du chromatogramme TAG, à l&#39;exception de la norme 13h00, ont été additionnées et divisées par l&#39;aire sous le pic 13h00. De même, pour déterminer le montant total normalisé PL, l&#39;aire sous tous les pics, à l&#39;exception de la norme 17h00, ont été additionnées et divisées par l&#39;aire sous le pic 17h00. Les valeurs normalisées de la TAG et des échantillons PL sont ensuite utilisés pour calculer la finale TAG / PL ratio de l&#39;échantillon: <img src="/files/ftp_upload/50180/50180eq1.jpg" alt="L&#39;équation 1" fo:content-width="2.6in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180eq1highres.jpg"/> Il est à noter que les données de SPE-SMGC permettre une analyse beaucoup plus approfondie des acides gras présents dans chaque fraction lipidique de calcul simple de la TAG total à taux de PL. Par exemple, l&#39;enquêteur peut intégrer un seul pic correspondant à un seul acide gras et de comparer l&#39;abondance normalisée pour tous les échantillons (par exemple cOMPARAISON dans N2 de type sauvage par rapport daf-2 ARNi la zone intégrée du pic 18:00 divisé par le pic de 13h00 standard, normalisé à PL masse totale divisée par PL 17h00 aire standard crête): <img src="/files/ftp_upload/50180/50180eq2.jpg" alt="L&#39;équation 1" fo:content-width="4.873in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180eq2highres.jpg"/> Si l&#39;enquêteur choisir, il serait également possible de déterminer le pourcentage de tout l&#39;acide gras donné dans le TAG ou fractions PL en pourcentage de la quantité totale d&#39;acides gras quantifiés (comme par exemple 18h00 dans la fraction TAG vers N2 ): <img src="/files/ftp_upload/50180/50180eq3.jpg" alt="L&#39;équation 1" fo:content-width="4.123in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180eq3highres.jpg"/><img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig1.jpg"alt = &quot;Figure 1&quot; fo: content-width = &quot;3,25 po&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50180/50180fig1highres.jpg&quot; /&gt; Figure 1. Flux de travail typique pour l&#39;expérience globale. Jour 1, congelés ARNi plaques de bibliothèque sont estampillés sur Amp / Tet plaques de gélose LB et incubées à 37 ° C. Jour 2, Amp / Tet plaques sont utilisées pour les cultures de semences liquides de clones d&#39;ARNi dans des blocs profonds ainsi. Jour 3, les bactéries sont concentrées par centrifugation et transférées à des plaques 96 puits ARNi. Jour 4, L1 nouveau-nés C. elegans sont ajoutés aux plaques d&#39;ARNi en liquide et on laisse sécher. 7 jours, les animaux sont rassemblés dans un liquide, colorées avec du Nil rouge à 40% d&#39;isopropanol, montées sur des lames en téflon 96-puits, et visualisée à l&#39;aide d&#39;un microscope à haut débit. <img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig2.jpg" alt="Figure 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180fig2highres.jpg"/> Figure 2. Fixateur à base de taches rouges du Nil grands <em&gt; C. elegans réserves de graisse. Représentant fond clair et les images fluorescence de la GFP sont présentés des vers nourris de N2 FASN-1 (faible, faible en gras), lpd-3 (faible en gras), de contrôle (vecteur vide), ou daf-2 (élevée en gras) clones d&#39;ARNi. Les échantillons ont été traités selon le protocole (schéma de la figure 1). Animaux fixés, colorés en rouge Nil, et le résultat imagée dans les taux de lipides comparables, obtenu à partir de mesures des lipides biochimiques. Isopropanol-Nil fixes rouges niveaux de fluorescence, acquises à partir d&#39;au moins 6 réplicats biologiques, sont présentés dans la première rangée. Les niveaux de triglycérides quantitatives, de réflexion de l&#39;ensemble des réserves de lipides neutres lorsqu&#39;ils sont normalisés à des niveaux globaux de phospholipides (TAG / PL), prises à partir de 4 réplicats biologiques, sont présentés dans la deuxième rangée. Il est important de noter que la quantification absolue obtenue à partir de fixateur coloration au rouge Nil et la détermination des lipides biochimiques souvent ne correspondent pas parfaitement. Dans ce cas, bien que qualitativementsimilaire, FASN-1 (ARNi) a une masse de triglycérides plus différent par rapport au contrôle par des méthodes biochimiques que celle indiquée par microscopie, lpd-3 est comparable différent, et daf-2 (ARNi) est moins différente, même si les différences sont statistiquement très significatifs et mesures étaient hautement reproductibles. Les données présentées sont des moyennes ± SEM (*, P ≤ 0,01; **, P ≤ 0,0001 par rapport au témoin, déterminée par non apparié, bilatéral T-test supposant que la variance égale). <img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. La masse grasse déterminée par la fixation du Nil coloration au rouge à différents stades larvaires. Les animaux ont été cultivés sur OP50 bactéries et recueillis à la L1, L2, L3, L4 et adultes gravides stades de développement. Les images ont été capturées après coloration de fixation et analysées à l&#39;aide d&#39;un script personnalisé Matlab pour déterminer la 90 e centile of intensité des pixels sur la zone de ver identifié. A noter que les taux de lipides des animaux grandement augmenter à mesure que l&#39;animal se développe de L2 à L4 scène, puis diminue légèrement à mesure que l&#39;animal commence à détourner les calories à la prolifération de la lignée germinale dans le stade adulte. Les données présentées sont des moyennes ± SEM de 6-8 répétitions (**, P ≤ 0,0001 par rapport à l&#39;adulte gravide, déterminée par non apparié, bilatéral T-test). <img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig4.jpg" alt="Figure 4"/> Figure 4. Haute reproductibilité travers indépendante biologique répétitions. Montré est un diagramme de dispersion des intensités de fluorescence rouge du Nil à travers biologique répétitions (n = 6-8). Pour chaque répétition, toutes les valeurs sont normalisées à l&#39;intensité moyenne des témoins vecteur vide. Les données présentées sont des moyennes ± SEM (**, P ≤ 0,0001 par rapport au témoin, déterminée par non apparié, bilatéral T-test en supposantvariance égale). <img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig5.jpg" alt="Figure 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180fig5highres.jpg"/> Figure 5. GC-MS chromatogrammes de SPE séparés normes et TAG de type sauvage et l&#39;abondance PL. (A) GC-MS sont présentés traces de la séparation SPE de TAG et les normes de PL. Noter l&#39;absence totale d&#39;acide gras 13:00 dans la trace et l&#39;absence PL correspondant de l&#39;acide gras dans l&#39;17:00 TAG trace, ce qui indique une séparation complète de TAG (tritridecanoin) de PL (1,2-diheptadecanoyl-sn-glycéro -3-phospho-(1&#39;-rac-glycérol)). (B) Un spectre complet représentant de TAG et PL à partir d&#39;un échantillon de N2 animaux de type sauvage nourri vecteur ARNi contrôle (HT115 bactéries avec L4440 vide ARNi vecteur). Un microlitre d&#39;échantillon a été injecté dans un SMGC Agilent 6890/5973N selon le protocole, et les pics individuels ont été identifiés par retention temps et leurs spectres de masse respective. Abréviations: acide cyclopropane cyclo, gras, iso:. Iso-méthylique d&#39;acide gras à chaîne ramifiée; GLA, acide gamma-linolénique, ALA, l&#39;acide alpha-linolénique; DGLA, l&#39;acide dihomo gamma-linolénique, EPA, acide eicosapentaénoïque <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50180/50180fig5large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> .

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Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Nous présentons robustes méthodes biochimiques et microscopiques pour l&#39;étude<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Réserves lipidiques. Un rapide, simple, fixer-la procédure de coloration pour l&#39;imagerie fluorescente gouttelettes lipidiques exploite les propriétés spectrales du colorant rouge lipophile du Nil. Nous présentons ensuite la mesure biochimique des triglycérides et des phospholipides par extraction en phase solide et chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse.

Biochimique et High Throughput évaluation microscopique de la masse grasse dans<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

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