Name: biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2013-03-30T14:00:00
Duration: 16 min 7 s
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Nos gustaría dar las gracias a Michael Kacergis de asistencia técnica y Wu Lianfeng para los debates y la lectura del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por un premio de desarrollo de la carrera de la NIH / NIDDK (K08DK087941 a AAS), un NIH / NIDDK formación de subvención (5T32DK007028 en ECP), la Ellison Medical Foundation Scholar Award en Nueva Envejecimiento (a AAS) y el Charles H . Capucha Niño Fundación Health Research Award (a AAS).

1. Preparación de rectangular Amp / Tet (A / T) placas de agar LB y placas NGM IPTG RNAi A placas / T debe estar preparado 1-4 semanas antes de su uso y se almacenaron en la oscuridad a 4 ° C. <ol><li> Para 1 l de medio añadir 1 l de agua desionizada, 32 g de agar LB, 1,5 ml de 2 M NaOH y 2 g de agar Bacto. Autoclave 40 min en ciclo líquido. Después de enfriar a 60 ° C, añadir 3 ml de tetraciclina y 0,5 ml de ampicilina. Verter 45 ml de medio en cada placa. </li></ol> Preparar 96-y placas RNAi 3 días hasta 2 semanas de antelación. <ol start="2"><li> Para verter 25 placas de 96 pocillos de ARNi, preparar 1 L de crecimiento de nematodos medios (NGM): 1 l de agua desionizada, 3 g de NaCl, 17 g de agarosa, y 2,5 g de bactopeptona. Ciclo de autoclave líquido a 121 ° C durante 40 min con una barra de agitación. Dejar enfriar, revolviendo en un conjunto placa caliente a 60 ° C. </li><li> Cuando se enfríe a 60 ° C, añadir las siguientes soluciones madre: 1 ml 1 M MgSO 4, 1 ml 5 mg / ml de colesterol, 25 ml 1 M KH 2 </sub&gt; PO 4 (pH 6,0), 1 ml de 1 M CaCl 2, 1 ml de 200 mg / ml de carbenicilina, y 5 ml de 1 M de IPTG (ver tabla Materiales para recetas). </li><li> Dispensar 150 l de RNAi medios de comunicación en cada pocillo de un fondo plano de 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal electrónica. Evitar burbujas de aire. Mantenga el material en un recipiente de acero inoxidable estéril inmerso en un baño de agua a 60 ° C, mientras que la dispensación. </li><li> Mantenga RNAi nivel placas de agarosa hasta que se solidifica. Las placas pueden ser vertido hasta 2 semanas de antelación y se almacenó a 4 ° C. </li></ol> Día 1 2. Sello Platos congelados Biblioteca hasta rectangular Amp / Tet (A / T) placas de agar LB <ol><li> Calienta platos A / T a temperatura ambiente, manteniéndolos en la oscuridad. </li><li> Transferencia de placas de 96 pocillos de la biblioteca de ARNi de -80 ° C en hielo seco. Abra la placa de aluminio sellada cerca de un mechero Bunsen. </li><li> Esterilizar un replicador de 96-pin en serie mediante la inmersión de los pins (10 segundos cada uno) en el 10% de lejía, desionizada H 2 O, y el 70% EToh seguido pasando pins través de una llama. Repita EtOH y paso de llama. </li><li> Aplicar replicador para congelado de 96 pocillos de glicerol RNAi, asegurándose de que cada pasador de contacto con la superficie de cada pocillo. </li><li> Sello en un plato / T, dibujando un pequeño círculo con cada pin sin dañar la superficie de agar. </li><li> Placas del sello Re-biblioteca y regreso a -80 ° C. Incubar las placas de sellado A / T a 37 ° C durante la noche para el crecimiento bacteriano. </li></ol> Día 2 3. Crecer RNAi clones bacterianos Noche en pozos profundos Blocks <ol><li> Retire las placas A / T de 37 ° C y confirmar el crecimiento bacteriano. </li><li> Llenar cada pocillo de un bloque de 96 pocillos de pozo profundo con 1,5 ml de LB con 200 mg / ml de carbenicilina. </li><li> Esterilizar 96-pin replicador (ver paso 2.3). </li><li> Aplicar replicador a la parte superior de la placa A / T, por lo que los pins seguro de hacer contacto con cada clon bacteriano RNAi. Levante replicador y pins sumerja en el bloque de pozo profundo. Remolino, y retire lentamente, por lo que certain de no contaminar los pozos adyacentes. </li><li> Selle bloque con breathe-easy película. Incubar durante una noche a 37 ° C con agitación (950 rpm en MT Infors Microtiteron II agitador, preferida, o 250 rpm en un 25 mm-tirar incubadora de agitación). </li></ol> Día 3 4. Semillas RNAi clones bacterianos en 96 pocillos NGM placas RNAi <ol><li> Eliminar placas de 96 pocillos de ARNi de 4 ° C y se calienta a temperatura ambiente. </li><li> Eliminar bloques de pocillos profundos y se centrifuga 10 min a 4.000 x g. </li><li> Rápidamente invertir bloques en fregadero para drenar los medios de comunicación, y el sello invertido en una toalla de papel para eliminar el exceso de material. </li><li> Bajo una campana de flujo laminar, añadir 40 l de LB con 200 mg / ml de carbenicilina a cada pocillo y sellado con película estéril. </li><li> Volver bloques a temperatura ambiente bacteriana agitador durante 10 min para resuspender pellets, gránulos o manualmente resuspender por pipeteado cuidadoso. </li><li> En la campana de flujo laminar, retire la película de transferencia estéril y bacterias de profundasbloques bien sobre placas de 96 pocillos RNAi. Añadir 40 l de bacterias resuspendidas a filas &#39;A&#39; y &#39;H&#39;, y l 35 de todas las otras filas. Más líquido se añade a los pocillos de borde de la placa de 96 pocillos RNAi para evitar un secado excesivo y agrietamiento de la agarosa. </li><li> Deje que se seque placas descubiertas en campana durante 4-6 horas, inspeccionar regularmente para la resequedad. Bacterias secas parece claro, no turbia. Tapar, invertir las placas e incubar a temperatura ambiente durante la noche. </li></ol> 5. Preparar una población síncrono de Worms Dos placas de 10 cm llena con muchos gusanos grávidas se utiliza para la preparación de huevos por cada 6 placas de 96 pocillos de RNAi. Asegúrese de que los gusanos no son de hambre durante al menos dos generaciones (7 días). <ol><li> Preparar una población síncrono de L1 como se ha descrito previamente 20. Para 20 ml de solución de cloro, utilizar 4 ml de lejía, 1 ml de NaOH (10 M), 5 mL de agua desionizada H 2 O, y 10 ml de tampón de M9. </li><li> Sincronizar los gusanos durante la noche en 10 ml M9 en un estéril de 15 mlpolipropileno tubo con rotación a 20 ° C. </li></ol> Día 4 6. Añadir a Worms placas RNAi <ol><li> Centrifugar preps de huevo a 3.000 xg durante 1 min. Aspirar el sobrenadante, mantenerse alejado de la pastilla de L1 crías. Resuspender en 5 ml de tampón M9 con 0,0005% de Triton X-100. La adición de la pequeña cantidad de detergente evita que los gusanos se pegue a la pipeta y no tiene ningún efecto en la tinción de la grasa. </li><li> Contar los gusanos con un microscopio. Si es necesario, ajustar la concentración de 10-15 gusanos por microlitro. </li><li> En la campana de flujo laminar, para cada placa de 96 pocillos se sembraron, añadir 75 l de gusanos resuspendidas en cada pocillo de una fila de un bloque de ensayo de poca profundidad así. Usando una pipeta multicanal manual, añadir 50-75 gusanos en 5 l en cada pocillo de las placas de 96 pocillos de RNAi. </li><li> Permita que las placas para secar en la campana durante 30 a 60 min. Una vez seco, bajo el microscopio, gusanos surgiera un rastreo, no paliza. </li><li> Crecer gusanos en placas RNAia 20 ° C durante ~ 64 horas. </li></ol> Día 7 7. Fijar y maquillaje Gusanos en Rojo Nilo <ol><li> Retire las placas de RNAi de la incubadora. Examinar al microscopio y registro hambre o paliza (húmedo) pozos para excluir del análisis adicional, ya que estas condiciones afectan a la masa grasa. </li><li> Uso de una pipeta de repetición electrónico, añadir 150 l de PBS con 0,01% de Triton X-100 a cada pocillo de una placa de RNAi. Con un manual de pipeta multicanal, mezcla y transferencia de líquido con gusanos de la fila correspondiente en una placa de 96 pocillos profundos PCR. No perturbar el agar. Repetir para un total de 300 gusanos mu l en PBS por pocillo. </li><li> Cuando las placas cuatro han sido transferidos, centrifugar las placas a 500 rpm durante 1 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante usando un aspirador de vacío 96-pin, dejando ~ 25 l de líquido y el gusano de sedimento en el fondo del pozo. </li><li> Añadir 150 l de 40% de isopropanol a cada pocillo para fijar los animales. Asegúrese de que la pipeta está en una velocidad lo suficientemente alta para mezclar gusanopellet con isopropanol 40%. Incubar a temperatura ambiente durante 3 min. </li><li> Centrifugar las placas no cubierto a 500 rpm durante 1 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante usando un aspirador de 96-pin o manualmente, dejando sólo 25 l 40% de isopropanol + gusano sedimento en el fondo del pozo. </li><li> Para cada pocillo, añadir 150 l de solución de tinción con rojo Nilo prepararse inmediatamente antes de su uso: 6 l Nilo solución rojo stock de 0,5 mg / ml en acetona por 1 ml de isopropanol 40%. </li><li> Junta de la placa con película de adhesivo no estéril y mancha en la oscuridad durante al menos 2 h. </li></ol> 8. Lavar y Worms Imagen de un microscopio de alto rendimiento <ol><li> Centrifugar a 500 rpm durante 1 min y aspirar todo pero 25 l de colorante rojo Nilo. </li><li> Añadir 150 l de PBS con 0,01% de Triton X-100 a cada pocillo y almacenar en la oscuridad durante al menos 30 min. </li><li> Centrifugar a 500 rpm durante 1 min. </li><li> Utilizando una pipeta de 12-canales, los animales aspirado desde el fondo de cada pocillo con 2 x 7 l rápidaaccidentes cerebrovasculares y dispensar en un portaobjetos de vidrio de 96 pocillos Teflon-impreso. Con cuidado, sin eliminar gusanos, quitar 9,5 l de PBS de cada pocillo de la corredera. Si el portaobjetos de vidrio no encaja directamente en su montaje microscopio, un soporte personalizado mecanizada corredera de aluminio debe ser usado para montar los gusanos. </li><li> Baje lentamente la cubierta deslizante en diapositivas de 96 pocillos. Este paso puede tomar un poco de práctica para evitar burbujas o cruce de gusanos en otros pozos. Esquinas seguras con rumbo adhesivo. </li><li> Foto de imagen en campo claro y fluorescencia con un filtro de GFP / FITC establecido en un microscopio automatizado. Los fotoblanqueadores señal de lípidos fácilmente por lo que debe ser reflejado de manera sistemática en todos los pocillos, no manualmente, como photobleaching dará lugar a diferencias artificiales entre los pozos. Para más detalles sobre el análisis, consulta y discusión Los resultados representativos. </li></ol> 9. Determinación de lípidos bioquímicos utilizando extracción en fase sólida (SPE) y cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC / MS) <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Para la validación de los niveles de lípidos basados ​​en fluorescencia de color rojo Nilo, cromatografía de gases seguido por análisis de espectrometría de masa (GC / MS) se puede realizar en ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) derivados de triacilgliceroles (TAG) y fosfolípidos (PL) desde pellets de lombriz. Etapas que implican orgánicos debe realizarse bajo una campana de humos. Se debe tener cuidado de que los lípidos se mantuvo bajo nitrógeno protegido de la luz durante el almacenamiento prolongado o etapas de incubación ya que son muy vulnerables a la oxidación. Bolitas de gusano de 2,500-5,000 animales síncronos se utilizan como entrada, preparado exactamente como antes, excepto que los animales se cultivan en placas de 10 cm de RNAi. <ol><li> Lavar 2,500-5,000 gusanos de cada placa de 10 cm con 10 ml de tampón de M9 en un tubo de 15 ml de polipropileno cónico. Pellet gusanos a 500 xg durante un minuto, y lavar de nuevo sedimento con 10 ml de tampón M9. Pellet animales a 500 x g. Aspirar dejar 250 l de volumen total, y la congelación ya sea en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C bajo nitrógeno for su posterior procesamiento o proceder directamente. </li><li> El gusano pellet puede ser llevada directamente al paso 9.3 si la masa de triglicéridos se normalizan a la masa de fosfolípidos 8,13,21. Sin embargo, si el investigador desea normalización al contenido de proteína o el contenido de ADN, el gusano pellet debe sonicó en la intensidad más alta en un baño de ultrasonidos durante 10 min, 30 seg en, 30 s apagado, a 4 ° C. Si normalización proteína o ADN que se desea, retirar una alícuota de 5 l y determinar la concentración de proteína total usando un reactivo de Bradford o el contenido de ADN similar o total después de la purificación en columna usando un espectrofotómetro UV. </li><li> Añadir los gusanos a 1,5 ml de 2:1 de cloroformo: metanol en un tubo de vidrio de borosilicato de roscado. Todas las transferencias de disolventes orgánicos debe hacerse utilizando pipetas de vidrio. </li><li> Usando una pipeta wiretrol 50 l, añadir 25 nM estándar de fosfolípidos en 50 l, y el 16,7 nM nivel de triglicéridos en 50 l. Ambas normas se debe disolver en 2:1 cloroformo: metanol, bien cerrado,y se almacena bajo nitrógeno protegido de la luz en un congelador -80 ° C para evitar la oxidación. </li><li> Gorra con tapa fenólica y el vórtice. Extraer durante 1 hora a temperatura ambiente, agitación cada 15 min. </li><li> Centrifugar a 1.000 rpm durante 5 min. Transferir la fase inferior orgánica sin cadáveres a un tubo de cultivo de borosilicato. </li><li> Añadir 0,3 ml de NaCl al 0,9%, vortex y se centrifuga a 1.000 rpm durante 5 min. </li><li> Transferir la capa orgánica inferior a un tubo de cultivo de borosilicato fresco, asegurándose de no transferir más de cualquiera de la fase acuosa. </li><li> Fase orgánica seca en atmósfera de nitrógeno. Para comenzar la extracción en fase sólida (SPE) resuspender seca de lípido en 1 ml de cloroformo. Alternativamente, para la separación y análisis detallado de las clases de lípidos distintas, incluyendo las clases de fosfolípidos, glicolípidos, esfingolípidos, diacilgliceroles, triglicéridos, ácidos grasos libres y ésteres de colesterol, cromatografía en capa fina como por primera vez por el laboratorio de Watts en C. elegans 22 se puede utilizar en lugar de SPE. B lípidos pueden tambiéne separaron por HPLC y las fracciones analizadas por GCMS. Métodos sofisticados de todo-lipidome perfilado por liquid-chromatography/MS (LCMS) también se puede utilizar 23-26. </li><li> Ensamble de columna de sílice SPE en el colector SPE. Pre-equilibrar la columna con 3 ml de cloroformo. Llevar el solvente a flujo por gravedad. </li><li> Carga de la muestra lipídica en una columna SPE, la recogida de flujo a través de un tubo de borosilicato roscado como parte de la primera fracción (fracción TAG). La mayoría de los lípidos neutros vendrá a través en este primer 1 ml de flujo continuo. Añadir 3 ml de cloroformo para eluir completamente fracción TAG, la recogida de flujo a través del tubo fracción TAG. </li><li> Retirar y tapar el tubo de recogida de primero, y sustituirlo por un tubo de recogida limpio. Eluir glicoesfingolípidos con 5 ml de acetona: metanol 9:1. No rutinariamente analizar la composición de ácidos grasos de esta fracción, sin embargo, puede contener información valiosa y se puede guardar para la preparación de ésteres de metilo y bases esfingoide libre para el análisis adicional utilizandoprocedimientos especializados distintos de los de TAG y PL como se ha descrito previamente 27. </li><li> Vuelva a colocar el tubo de recogida glicoesfingolípido con un segundo tubo roscado colección de borosilicato. Se eluye con metanol fosfolípidos ml 3 (fracción PL). </li><li> Las fracciones se pueden almacenar a -80 ° C en este punto tapó herméticamente en atmósfera de nitrógeno. Dry lípidos purificados bajo nitrógeno. Para acelerar el secado, en un bloque de calentamiento en seco a 33 ° C. Nunca almacenar lípidos en forma seca, ya que son especialmente susceptibles a la oxidación en el estado seco. </li><li> Resuspender las fracciones lipídicas secas en 2 ml 2% de H 2 SO 4 en metanol por agitación e incubar bien cerrado durante la noche en un baño de agua a 55 ° C para crear FAMEs. Se debe tener cuidado para conseguir absolutamente nada de agua en la reacción de FAME, ya que en gran medida inhibir la derivación de los lípidos. Hemos encontrado derivatización más eficiente por incubación durante la noche y sugiere la literatura de oxidación inferior lípidos se produce a temperaturas más bajas during FAME preparación 28. Un método alternativo y más rápida es usar 2 ml 2,5% H 2 SO 4 en metanol y derivatizar durante una hora a 70 o 80 ° C 21,22,29. </li><li> A la mañana siguiente, retirar del baño, y se deja enfriar. Añadir 1,5 ml de H 2 O (para extinguir la reacción) y, a continuación 0,3 ml de hexano (para extraer los FAMEs) a cada CTC y la fracción de PL. Agitar vigorosamente y se centrifuga a 1.000 rpm durante 5 min. </li><li> Con mucho cuidado, quite sólo la capa superior de hexano con una pipeta estándar o pipeta Pasteur. Vierta en el tubo muestreador automático. Asegúrese de no incluir ninguna metanol acidificado ya que esto va a destruir la columna GC y MSD. </li><li> Cap y las muestras de carga en GC / MS. La muestra se transfiere en hexano a un vial de micro-inserto Agilent tapado con un tapón de rosca de PTFE silicona PTFE. Se transfiere a la 6890/5973N modelo Agilent GCMS equipado con un Supelcowax-10 (24079) 30 metros, 250 micras columna capilar de sílice fundida. Un microlitro se inyecta intentrada de OA splitless fija en 250 ° C y 13,33 PSI ultrapura El helio se utiliza un gas portador. La ejecución del protocolo es el siguiente en una constante de 1 ml por min: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Paso </td><td> Instrucción </td><td> Objetivo Temperatura </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Mantenido 2 min </td><td> 150 ° C </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Rampa de 10 ° C por min </td><td> 200 ° C </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Mantener 4 min </td><td> 200 ° C </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Rampa de 5 º C por minuto </td><td> 240 ° C </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Sostenga 3 min </td><td> 240 ° C </td></tr><tr><td> 6 </td><td> Rampa de 10 ° C por min </td><td> 270 ° C </td></tr><tr><td> 7 </td><td> Hold 5 min </td><td> 270 ° C </td></tr></tbody></table> Un retraso de 3 min se utiliza un solvente en el MSD para minimizar el desgaste de la filAment. Después de ello, las masas de entre 50 y 550 Daltons se detectan con el conjunto MS cuádruple a 150 º C y la fuente ms fijó en 230 ° C, con una temperatura térmica auxiliar de 270 ° C.

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Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar.

El protocolo presentado permite la selección rápida, a gran escala de los niveles de lípidos en C. elegans, que se pueden adaptar fácilmente a pantallas de alto rendimiento. A diferencia de los métodos utilizados anteriormente, que implican una etapa de fijación en paraformaldehído largo seguido de varios ciclos de congelación-descongelación 8,10, nuestro protocolo requiere un simple 3-min fijación en isopropanol. Se ha encontrado que mediante la tinción C. elegans en 40% de isopropanol, se vuelven permeables a Rojo Nilo, sin el uso de etapas adicionales de congelación-descongelación o fijación. También, como rojo del Nilo selectivamente fluoresce en compartimentos hidrófobos en el espectro verde 18,19,31, no decolorante es necesario. En total, los animales pueden ser tomadas de placas de RNAi para animales imagen manchado y listo para en poco más de 2,5 hr. Este método puede realizarse de manera relativamente económica y con una alta reproducibilidad. El método no depende de la capacidad de C. elegans a la absorción o concentradoel colorante, y por lo tanto no tiene las mismas limitaciones que los métodos basados ​​en la alimentación usando colorantes vitales. Dada la reproducibilidad y la precisión de las mediciones, el método es adecuado para el cribado de un gran número de inactivaciones de genes de RNAi. Si la cuantificación de los niveles de lípidos se desea basada en fijador Nilo tinción con rojo, se recomienda el uso de 4-6 repeticiones biológica con los controles apropiados y las pruebas de estadística aplicada. Es probable que muchos genes inactivaciones que conducen a pequeños animales (debido a los clones RNAi causando retraso en el desarrollo o detenido) salía de una pantalla para los reguladores de grasa, independientemente de cualquier relación con el metabolismo de la grasa. Mientras que el programa de análisis de imagen que utiliza cuentas para los gusanos de diferentes tamaños mediante la normalización de la intensidad de fluorescencia a la zona de gusano, los investigadores individuales también pueden considerar la comparación de los niveles de tinción de grasa de animales pequeños con los animales de tipo salvaje de una etapa de desarrollo similar. En lacaso de animales pequeños o detenido su desarrollo con aparente masa grasa bajo, sugerimos que ninguna modalidad individual es suficiente para demostrar el metabolismo lipídico alterado. Varios experimentos de seguimiento, incluidas las SPE-GC-MS, podrían ser necesarios para determinar la función de regulador de lípidos de estos genes. Para el regulador metabólico conocido fasn-1, SPE-GC-MS análisis en comparación con el desarrollo emparejados L2 N2 animales control fue necesario confirmar el fenotipo aparente baja grasa que se encuentra en comparación con animales de control de adultos. Mientras rojo Nilo tinción grasa indicado más bajos niveles relativos de grasa para controlar adulto RNAi, en comparación con los animales emparejados etapa-L2 de control de ARNi, sin diferencia aparente fue visto. En consecuencia, el uso de un segundo método, es decir, la cuantificación bioquímica de la relación de TAG / PL fue necesario determinar que fasn-1 es un regulador verdadero de la masa grasa, como fasn-1 RNAi es bioquímicamente distinguible de emparejados etapa-L2 animales de control RNAi. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Aunque presentamos formación de imágenes y de procesamiento de una plataforma de alto rendimiento, un microscopio vertical convencional se puede utilizar fácilmente para capturar imágenes desde gusanos montados en agarosa almohadillas 20 o el tamaño convencional de Teflon-impresa desde 8 hasta 12 portaobjetos de microscopio así . La única limitación es que, como la fluorescencia verde de las gotitas de lípidos teñidas con rojo Nilo fotoblanqueadores rápidamente, las condiciones sistemáticas, exposición uniforme deben ser utilizados para garantizar la comparabilidad entre las imágenes. Encontramos que un microscopio totalmente automatizado con condiciones uniformes de adquisición de imágenes que funciona mejor en este sentido. Una de las grandes fortalezas de este protocolo es que después de las imágenes que se recogen se pueden guardar para futuras re-análisis. Las mismas imágenes se podrían utilizar para determinar el tamaño del cuerpo, además de contenido de grasa. Además, como los programas informáticos más avanzados, existe la posibilidad para el análisis solo gusano, generar resultados estadísticamente significativosde un solo pozo. Así, nuestro método que utiliza la microscopía de alto rendimiento tiene algunas ventajas sobre metodologías de pantalla publicados que usan un Biosort Copas para cuantificar las señales fluorescentes 32,33. Sin embargo, las metodologías son definitivamente gratuito. Determinación precisa, bioquímica de contenido de lípidos por SPE y GC / MS confirma la tinción de rojo Nilo de los grandes almacenes de grasa en C. elegans. Aunque la cuantificación absoluta de lograr fijador Nilo tinción con rojo y la determinación bioquímica de lípidos a menudo no coinciden perfectamente, ambos métodos producen resultados altamente reproducibles, estadísticamente significativos que concuerdan cualitativamente. Además, este método puede ser adaptado para satisfacer las necesidades específicas de los investigadores individuales que pueden requerir un análisis más detallado de las distintas clases de glicoesfingolípidos, fosfolípidos, triglicéridos o presentes en varias muestras. Debe tenerse en cuenta que otros grupos han utilizado la tecnología de otro THAn SPE para separar las clases de lípidos antes de la GC / MS 22. Cromatografía en capa fina (TLC) y cromatografía líquida de alta presión (HPLC) tiene ventajas sobre SPE en que podría ser capaz de separar mejor los lípidos neutros (por ejemplo, distintas TAG, diacilgliceroles, de ácidos grasos, y ésteres de colesterol) a partir de lípidos polares (fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina) y glicol-esfingolípidos. Elegimos SPE, ya que requiere un mínimo de material de partida (2.500-5.000 gusanos), que hace hincapié en los importantes a largo plazo las reservas de energía, las etiquetas, que constituyen la mayor parte de la fracción lipídica neutral 4, y es rápida, sin necesidad de equipo especializado o placas. Cabe destacar que en base a las mezclas estándar, SPE separa completamente TAGs de PLS, y es altamente reproducible y fiable (véase la Figura 5A). Aunque la cuantificación y análisis de ésteres metílicos de ácidos grasos requiere un GC / MS, este equipo está comúnmente disponible, y si no a nivel local, pueden muestrasser generado como anteriormente y se almacenan a -80 ° C en atmósfera de nitrógeno hasta que el análisis por un colaborador o servicio comercial de GC / MS se dispone. La salida GCMS contiene datos de alta resolución de cada ácido graso dentro de cada especie de lípidos. Esto permite la determinación de diferencias detalladas entre las muestras comparadas. Como ejemplo, el investigador podría determinar si los niveles de ciertos ácidos grasos se han alterado en abundancia significativamente más que otras en daf-2, lpd-3 o fasn-1 RNAi versus control vectorial. Esta herramienta muy poderosa tanto, puede proporcionar información detallada sobre las especies de lípidos se alteran en abundancia con toda manipulación experimental. Para nuestro análisis, lo más a menudo normalizar TAG masa a masa PL. Mientras que la proteína o ADN también podría ser utilizado para normalizar la masa lipídica después de la determinación de una parte alícuota de gusano sonicado pellet, encontramos que estos métodos están sujetos a introduced error humano durante todos los pasos de pipeteo y en la recuperación de la muestra de cada extracción. Es por esta razón por la que se optó por utilizar en lugar PL masa como nuestro factor de normalización. Normas no naturales introducirse al inicio del protocolo (tritridecanoin para TAG, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glicero-3-fosfo-(1&#39;-rac-glicerol) para PL) se realizan a través de todos los pasos de la extracción en fase sólida y preparación FAME, y garantizar la recuperación cuantitativa y representativa tanto TAG y fracciones PL. La misma garantía no es aplicable si los investigadores utilizar las proteínas o el ADN para normalizar la masa TAG. Creemos PL a ser la medida más sólida con la que comparar los niveles de TAG a través de muestras, como se ha demostrado anteriormente que sólo se PL minuciosamente alterada por el mismo estímulo efectuar grandes cambios de masa en los niveles de TAG, hambre extendida por ejemplo, o el aumento de ejercicio 34 - 36. PL se cree que desempeñan un papel estructural, asegurando fluidez de la membrana celular y la integracióngrity y funciones de señalización en lugar de como almacenamiento de energía 37-39. En nuestras manos, la relación de TAG / PL más se acerque a lo que se obtiene mediante tinción de lípidos fijador a base Nile con rojo, y coincide con lo encontrado por otros grupos 21. Una estrategia alternativa es utilizado por el laboratorio de Watts, donde se calcula el porcentaje de etiqueta lipídica frente a los lípidos totales 9,22,29. El uso de no nativos tipos de TAG y PL estándar garantiza que no ácidos grasos nativos se incluirán en el cálculo de normalización. La elección de la longitud de la cadena está puramente basado en la necesidad de estas normas para que no interfieran con los espectros de masas de los ácidos grasos nativos. Hemos encontrado que los ácidos grasos de 13:00 y 17:00 servir mejor a este propósito. Es posible, dadas las diferentes propiedades químicas de los ácidos grasos de cadena más corta, que nuestros estándares no naturales de ácidos grasos podrían no ser representativos de la recuperación de todos los ácidos grasos de longitud de cadena o cadenas con estaerent índices de saturación. Por lo tanto, es posible que durante SPE o GCMS podemos ver las diferencias en la eficiencia de la purificación o la detección entre los lípidos de diferentes longitudes de cadena. Basándose en esto y la ionización diferente de diferentes ácidos grasos en el GCMS, no es posible hacer una declaración sobre la abundancia absoluta de cualquier ácido graso dado. Por lo tanto, sólo comparar entre muestras dentro de un solo experimento abundancias de cualquier ácido graso determinado. Si se quisiera cuantificar absolutamente un ácido graso, una manera esto podría lograrse, sería ejecutar una muestra preparada como anteriormente se disparó con una cantidad conocida de una manera estable marcado con isótopos 13 C versión de que o ácido graso similar, por lo que podría ser distinguen basado en la masa del ión padre en el MSD, por ejemplo. Dado que solo estamos comparando cantidades relativas de las clases de lípidos o cualquier ácido graso, dado nuestro TAG 13:00 y 17:00 estándares PL servir a este propósito adecuadamente, en un mínimo de costo, aasegurar una recuperación adecuada y representativa de cada clase de lípidos. Hasta este punto, no ha habido una falta de consenso en cuanto a la interpretación de los resultados obtenidos por ciertas metodologías diferentes, y en qué las metodologías existentes debe ser. En general hay que señalar que no hay un método en el aislamiento es ideal para estudiar el metabolismo de la grasa en C. elegans. Sin embargo, mediante el uso de detección múltiple y las modalidades de validación, se puede lograr la confianza en los datos obtenidos en los genes reguladores de lípidos. Por lo tanto, tenemos la intención de nuestro protocolo de servir como punto de referencia para futuros trabajos en el campo de la C. elegans grasa investigación.

Conservación de las vías metabólicas entre los seres humanos y el nematodo Caenorhabditis elegans convierte en un organismo poderoso modelo para el estudio de la obesidad. Aunque C. elegans no tienen adipocitos dedicados al almacenamiento de grasa como en los mamíferos, lo hacen en una tienda de triglicéridos gotas de lípidos y poseen muchos de los mismos reguladores de almacenamiento de grasa y el consumo de energía 2,3. Para el ensayo de los niveles de grasa en C. elegans, varios métodos han sido propuestos con distintos niveles de facilidad y éxito. El uso común de una vez tintes fluorescentes, vitales 4-7 fue llamado recientemente en tela de juicio, y estos reactivos resultó ser manchando un compartimento distinto del depósito principal de almacenamiento de grasa de C. elegans 1,8-11. Fijador a base de tintes no fluorescentes, como Sudán y negro de aceite rojo O-, mientras que con éxito a poner de relieve las gotas de lípidos en el gusano 12-14, no tienen tan gran rango dinámico para la cuantificación como fluorescenciaciento tintes 8,13,15. Además, los métodos actuales de fijación de colorantes tanto fluorescentes y no fluorescentes son mucho tiempo e implican varios pasos de congelación-descongelación y / o el uso de productos químicos tóxicos 1,9,10. El uso de análogos de lípidos específicos BODIPY-etiquetados se ha informado para resaltar las gotas de lípidos cuando se alimenta a los gusanos vivos a corto término de etiquetado 15. Sin embargo, esto se basa en la captación del colorante y por lo tanto está sesgada por C. elegans manipulación y el metabolismo de BODIPY análogos de ácidos grasos. Una alternativa a los colorantes de tinción establecido en lípidos es sin etiqueta, coherente anti-Stokes Raman (CARS) o la dispersión Raman estimulada (SRS) de microscopía, que se aprovechan de las propiedades características de vibración de moléculas de lípidos para visualizar las reservas de grasa 10,16, 17. Sin embargo, el equipo especializado costoso es necesario para este método, y el rendimiento es bajo en el mejor. Para satisfacer una necesidad de análisis rápido y escalablesis de reservas de lípidos neutros en C. investigación elegans metabólico, introducimos un nuevo método altamente reproducible de fijador basado en la tinción de lípidos Nilo rojo. Las propiedades espectrales y fisicoquímicas de la lipófilo colorante rojo Nilo inducir un cambio de color amarillo-oro-espectral en su excitación-emisión pico, permitiendo que fluorescen en el espectro de emisión verde sólo cuando en un ambiente rico en lípidos, pero no en entornos más polares 18 , 19. Así, las gotas de lípidos puede ser detectada después de la tinción sencilla mediante el uso de una proteína verde fluorescente (GFP) del filtro para microscopía de fluorescencia. La facilidad y la accesibilidad de esta técnica hacen que sea ideal para las pantallas de alto rendimiento. También demuestran un emparejado, método riguroso para determinación bioquímica de triglicéridos y fosfolípidos utilizando extracción en fase sólida y cromatografía de gases-espectrometría de masa. Medición de lípidos Biochemical se correlaciona con la determinación del Nilo rojo basado microscópica de C. elegans famasa t, y debe utilizarse como una confirmación de los hallazgos realizados con determinación microscópica de lípidos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> 96-pin replicador </td><td> Nunc </td><td> 250520 </td><td></td></tr><tr><td> LB Agar </td><td> EE.UU. Biológicos </td><td> L1500 </td><td></td></tr><tr><td> Agarosa </td><td> Invitrogen </td><td> 16500500 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetas mecánicas </td><td> Biohit M Line </td><td> M10, M100, M300 </td><td></td></tr><tr><td> Electronic pipeta </td><td> Biohit E Line </td><td> E1200 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M KH 2 PO 4 </td><td> Sigma </td><td> P0662 </td><td> pH 6,0 esterilizados en autoclave </td></tr><tr><td> 1 M MgSO 4 </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td> Esterilizado por Autoclaving </td></tr><tr><td> 1 M CaCl 2 </td><td> Sigma </td><td> C2661 </td><td> Esterilizarse en autoclave </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S5886 </td><td></td></tr><tr><td> 5 mg / ml de colesterol </td><td> Sigma </td><td> C8667 </td><td> En 100% Etanol </td></tr><tr><td> 200 mg / ml carbenicilina </td><td> EE.UU. Biológicos </td><td> C1100 </td><td> Esterilizado por filtración 0,2 μ </td></tr><tr><td> 1 M IPTG </td><td> EE.UU. Biológicos </td><td> I8500 </td><td> Esterilizado por filtración 0,2 μ </td></tr><tr><td> 100 mg / ml de ampicilina </td><td></td><td></td><td> Esterilizado por filtración 0,2 μ </td></tr><tr><td> 5 mg / ml de tetraciclina </td><td></td><td></td><td> En 100% Etanol </td></tr><tr><td> Bacto Agar </td><td> BD </td><td> 214040 </td><td></td></tr><tr><td> 96-y placas TC </td><td> BD-Falcen </td><td> 353072 </td><td> Para los de 96 y RNAi </td></tr><tr><td> Placas rectangulares A / T </td><td> Thermo Scientific </td><td> 242811 </td><td> Para estampar RNAi </td></tr><tr><td> Medio LB </td><td> EE.UU. Biológicos </td><td> L1530 </td><td> Preparado según las instrucciones del fabricante </td></tr><tr><td> 96-y bloques profundamente pocillo de ensayo </td><td> Corning </td><td> Costar 3960 </td><td> Rectangular con fondo en V ensayo de bloque </td></tr><tr><td> De 96 pocillos Shallow Bloquear Ensayo Bueno </td><td> Corning </td><td> Costar 3956 </td><td> V Ronda de fondo ensayo bloque </td></tr><tr><td> Film de sellado estéril </td><td> VWR </td><td> 89134-432 </td><td></td></tr><tr><td> Aluminio película de sellado </td><td> Corning </td><td> Costar 6570 </td><td> Thermowell cinta de sellado para placas de 96 pocillos </td></tr><tr><td> M9 buffer </td><td> Ver Hope et al. 20 </td&gt; <td></td><td> Vea la receta a continuación </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0407 </td><td></td></tr><tr><td> Rojo Nilo </td><td> Invitrogen </td><td> N-1142 </td><td></td></tr><tr><td> Isopropanol </td><td> Pescador </td><td> BP2632-4 </td><td></td></tr><tr><td> 96-pin aspirador </td><td> VP Científico </td><td> VP177A-1 </td><td></td></tr><tr><td> 96-y teflón enmascarados preparaciones para microscopio </td><td> Thermo Scientific </td><td> Costumbre </td><td> También se puede pedir Trevigen de 96 pocillos Cometslide </td></tr><tr><td> 96-y Sello de Oro Cubre- </td><td> Thermo Scientific </td><td> Costumbre </td><td> También se puede utilizar de 96 segundos, así Cometslide </td></tr><tr><td> Deep-así placa PCR </td><td> VWR </td><td> 89049-178 </td><td></td></tr><tr><td> No estéril adhesivo película </td><td> VWR </td><td> 60941-070 </td><td></td></tr><tr><td> Alto Rendimiento Microscopio </td><td> Leica </td><td> DM6000 totalmente automatizado con la etapa previa de 96 pocillos </td><td> Con Chroma serie 49002 GFP filtro y objetivo 2x </td></tr><tr><td> Baño Sonicator </td><td> Diagenode </td><td> Bioruptor XL </td><td></td></tr><tr><td> Cloroformo </td><td> Sigma </td><td> 366927-4L </td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Pescador </td><td> Optima F456-4 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfolípidos estándar </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 830456P </td><td> 1,2-diheptadecanoyl-sn-glicero-3-fosfo-(1&#39;-rac-glicerol) </td></tr><tr><td> Triglicéridos estándar </td><td> NuChek Prep </td><td> T-135 </td><td> tritridecanoin </td></tr><tr><td> Wiretrol Pipetear 50 l </td><td> Pescador </td><td> 21-176-3A </td><td> Drummond Scientfic </td></tr><tr><td>Acetona </td><td> Sigma </td><td> 320110-4L </td><td></td></tr><tr><td> Ácido sulfúrico </td><td> Pescador </td><td> A300-500 </td><td></td></tr><tr><td> Hexano </td><td> Pescador </td><td> Optima H306-1 </td><td></td></tr><tr><td> Columna de sílice SPE </td><td> Thermo Scientific </td><td> 60108-317 </td><td> HYPERSEP SI, 100 mg lecho de resina </td></tr><tr><td> Cromatografía en Fase Sólida del colector </td><td> Sigma </td><td> 57265 </td><td> Supelco Visiprep 24-DL </td></tr><tr><td> Borosilicato pipetas </td><td> Pescador </td><td> 13-678-27F </td><td> 10 ml tamaño </td></tr><tr><td> Pipetas Pasteur borosilicato </td><td> Pescador </td><td> 13-678-8B </td><td></td></tr><tr><td> Los tubos de borosilicato Cultura </td><td> Pescador </td><td> 14-961-27 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos roscados borosilicato </td><td> VWR </td><td> 14235-460</td><td> 8 ml de capacidad </td></tr><tr><td> Caps fenólicos para tubos de cultivo </td><td> Pescador </td><td> 14-823-211 </td><td></td></tr><tr><td> GC / MS Autosampler Vials </td><td> Agilent </td><td> 5188-6592 </td><td></td></tr><tr><td> Tapones para viales Autosampler </td><td> Agilent </td><td> 5185-5861 </td><td></td></tr><tr><td> GC / MS </td><td> Agilent </td><td> 6890 GC / MSD 5973 </td><td> Equipado con una columna Supelcowax-10 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Nematodo Crecimiento Media (NGM): para 25 placas de 96 pocillos RNAi, preparar 1 L de NGM: <table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Cantidad </td></tr><tr><td> Agua desionizada </td><td> 1 L </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 3 g </td></tr><tr><td> Agarosa </td><td> 17 g </td></tr><tr><td> Bacto peptona </td><td> 2,5 g </td></tr><tr><td colspan="2"> Ciclo de autoclave líquido 121 ° C durante 40 min con una barra de agitación. Dejar enfriar a 60 ° C agitando en un conjunto de placa caliente a 60 ° C. A continuación, agregue el siguiente: </td></tr><tr><td> 1 M MgSO 4 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 5 mg / ml de colesterol </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 1 M KH 2 PO 4 (pH 6,0) </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td> 1 M CaCl 2 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 200 mg / ml de carbenicilina </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 1 M IPTG </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Distribuir en placas de 96 pocillos RNAi. Almacenar a 4 ° C hasta su uso, de hasta 2 semanas. </td></tr></tbody></table> Rectangulares ampicilina / tetraciclina placas de agar LB (A / T): para 20 placas A / T, preparar 1 l de medio: <table border="1"><tbody><tr><td&gt; Reactivo </td><td> Cantidad </td></tr><tr><td> Agua desionizada </td><td> 1 L </td></tr><tr><td> LB agar (EE.UU. Biologicals) </td><td> 32 g </td></tr><tr><td> 2 M NaOH </td><td> 1,5 ml </td></tr><tr><td> Bacto agar </td><td> 2,5 g </td></tr><tr><td colspan="2"> Ciclo de autoclave líquido 121 ° C durante 40 min con una barra de agitación. Dejar enfriar a 60 ° C agitando en un conjunto de placa caliente a 60 ° C. A continuación, agregue el siguiente: </td></tr><tr><td> La tetraciclina </td><td> 3 ml </td></tr><tr><td> 100 mg / ml de ampicilina </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Vierta 45 ml en cada placa. Almacenar en oscuridad a 4 º C hasta su uso, de hasta 4 semanas. </td></tr></tbody></table> Medio LB crecimiento bacteriano: para 4 litros, suficiente para el cultivo y resuspensión de 25 bloques de 96 pocillos Mezcle 62 g de polvo LB (Biologic EE.UU.ALS), 4 L de agua destilada, y 4,8 ml de 2 M NaOH. Autoclave en 1 L o alícuotas de 0,5 L, el ciclo de líquido, 40 min. Se puede almacenar hasta 1 año en botella hermético a temperatura ambiente. Desechar si nublado. 100 mg / ml de ampicilina Mezclar 5 g de ampicilina en polvo y agua desionizada hasta un volumen total de 50 ml. Filtrar esterilizar 0,2 μ, dispensar en alícuotas de 1 ml y congelar a -20 ° C hasta su uso. 5 mg / ml de tetraciclina Añadir 1,25 g de polvo de tetraciclina en 250 ml de etanol 100%. Mezclar bien hasta que esté completamente disuelto y se almacena a -20 ° C en un recipiente a prueba de luz. 200 mg / ml carbenicilina Mix 10 g de carbenicilina polvo y agua desionizada hasta un volumen total de 50 ml. Filtrar esterilizar 0,2 μ, dispensar en alícuotas de 1 ml y congelar a -20 ° C hasta su uso. 5 mg / mlColesterol Añadir 1,25 g de colesterol a 250 ml de etanol 100%. Mezclar bien y almacenar a 4 ° C durante un máximo de 6 meses. 1 M MgSO 4 Disolver 120,37 g MgSO 4 en 800 ml de agua desionizada. Llevar a un volumen final de 1 L. Autoclave 40 ciclos min líquido y se almacena a temperatura ambiente. 1 M CaCl 2 Disolver 110,98 g CaCl 2 en 800 ml de agua desionizada. Llevar a un volumen final de 1 L. Autoclave 40 ciclos min líquido y se almacena a temperatura ambiente. 1 M KH 2 PO 4, pH 6,0 Disolver 136,09 g de KH 2 PO 4 en 800 ml de agua desionizada. pH a 6,0 y llevar el volumen final a 1 L. Autoclave 40 ciclos min líquido y se almacena a temperatura ambiente. M9 buffer para 1 L-nos routinely hacer lotes 8-10 L Disolver 3 g de KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, 1 ml 1 M MgSO 4 en 900 ml. Llevar a un volumen final de 1 L. alícuotas en frascos 100-500 ml y esterilizar en autoclave 40 min en ciclo líquido y se almacena a temperatura ambiente. 10 N NaOH Disolver 400 g de NaOH en 800 ml de agua desionizada, se deja enfriar y llevar a un volumen final de 1 L. tienda en tubos de 50 ml a temperatura ambiente. 1 M IPTG Añadir 23,81 g IPTG a agua desionizada y se ajusta el volumen total a 100 ml. Filtrar esterilizar 0,2 μ, dispensar en alícuotas de 1 ml y congelar a -20 ° C hasta su uso. Preparación Huevo Bleach / NaOH Solución: 20 ml suficiente para la preparación de un huevo Añadir 4 ml de lejía, 1 ml de NaOH 10 N, 5 ml de H 2 O, y 10 mlM9 tampón a un tubo de polipropileno cónico de 50 ml. Hacer inmediatamente antes de su uso. Nilo rojo solución madre Añadir 50 ml de acetona al 100% a 25 mg de polvo rojo Nilo. Mezclar bien y almacenar a temperatura ambiente a la luz recipiente estanco al parafilmed. Se pueden almacenar durante meses en esta manera. Rojo Nilo solución de tinción: para 500 ml, suficiente para la tinción de 30 x 96 pocillos Añadir 3 ml de solución stock rojo Nilo a 500 ml 40% v / v de isopropanol. Guarde a temperatura ambiente en botella de vidrio envueltas en papel aluminio. Preparar inmediatamente antes de su uso. Fosfolípidos estándar Pesar 7,6 mg de fosfolípido estándar, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glicero-3-fosfo-(1&#39;-rac-glicerol), en un vaso de precipitados de vidrio. Disolver en 20 ml de 2:1 de cloroformo: metanol (25 nanomoles por 50 l). Mantener cubierto con papel de aluminio hasta su uso.Norma también se pueden mantener a -80 ° C en un vial de vidrio hermético con tapa fenólica durante 1 año. Triglicéridos estándar Pesar 6,8 estándar triglicéridos mg, tritridecanoin, en un vaso de precipitados de vidrio. Disolver en 30 ml de 2:1 de cloroformo: metanol (16,7 nanomoles por 50 l). Mantener cubierto con papel de aluminio hasta su uso. Norma también se pueden mantener a -80 ° C en un vial de vidrio hermético con tapa fenólica durante 1 año. </td></tr></tbody></table>

biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in caenorhabditis elegans

El nematodo C. elegans se ha convertido en un importante modelo para el estudio de las conservadas vías genéticas que regulan el metabolismo de la grasa y su relación con la obesidad humana y sus patologías asociadas. Varias metodologías anteriores desarrollados para la visualización de C. elegans ricas en triglicéridos reservas de grasa han demostrado ser errónea, destacando compartimentos celulares distintos de gotas de lípidos. Otros métodos requieren equipos especializados, requieren mucho tiempo, o producir resultados incoherentes. Se introduce un rápido, reproducible, fijador basado en la tinción con rojo Nilo método para la detección exacta y rápida de las gotitas de lípidos neutros en C. elegans. Una etapa de fijación corto en 40% de isopropanol hace que los animales completamente permeables a rojo Nilo, que luego se utiliza para teñir los animales. Las propiedades espectrales de este colorante lipófilo permitir que fuertemente y de forma selectiva en el espectro de fluorescencia de color amarillo-verde sólo cuando en un ambiente rico en lípidos, pero no en másambientes polares. Por lo tanto, las gotas de lípidos puede ser visualizada en un microscopio de fluorescencia equipado con capacidad de formación de imágenes sencilla GFP después de sólo una etapa de tinción breve rojo Nilo en isopropanol. La velocidad, la asequibilidad y la reproducibilidad de este protocolo lo hacen ideal para las pantallas de alto rendimiento. También demuestran un método emparejado para la determinación bioquímica de triglicéridos y fosfolípidos usando la cromatografía de gas-espectrometría de masa. Este protocolo más riguroso se debe utilizar como confirmación de los resultados obtenidos a partir de la determinación del Nilo rojo lípidos microscópico. Esperamos que estas técnicas se convertirá en nuevos estándares en el campo de la C. elegans metabólico investigación.

Un ejemplo de una placa con imágenes que se ha tomado a través del flujo de trabajo de tinción de grasa se ​​muestra en la figura 1. Controles específicos de alto grado en grasas (daf-2 del receptor de insulina RNAi), bajo en grasa (lpd-3 proteína necesaria para gránulos de almacenamiento de lípidos en el intestino RNAi), grasa pequeña y baja (fasn-1 de ácido graso sintasa RNAi), y el vector vacío ( control) muestran las variaciones en la intensidad de fluorescencia de acuerdo con los niveles de grasa de los animales, y las cantidades de lípidos correspondientes determinados por análisis GC / MS (Figura 2). Tenga en cuenta que inactivaciones genes que conducen a su desarrollo detenido, los animales pequeños a menudo parecen tener grasa mucho más bajo que los animales testigos adultos, con independencia de cualquier relación con el metabolismo de la grasa (Figura 3). Los análisis secundarios, incluido el análisis de tinción y bioquímica de los lípidos con SPE-GC-MS de control de los animales de tipo salvaje de una etapa de desarrollo similar debe hacerse para asegurar la validez depequeña o de desarrollo detenido éxitos positivos. En el caso de fasn-1 RNAi (Figura 2), la detención animales, ya sea en la L2 o L3 etapa larval, y tienen manchas de grasa inferior al control de los adultos RNAi, pero similar en abundancia a L2-L3 animales etapa de control (RNAi por ciento mancha grasa de adulto control de RNAi: 49,9 ± 4,5% para fasn-1 RNAi y 20,2 ± 2,1% para el control L2 RNAi, y 64,7 ± 1,3 para el control L3 RNAi). Por otra parte, el análisis bioquímico indicó un TAG inferior / PL relación de fase L2 emparejado N2 animales control (TAG / PL: 22,5 ± 2,9 para fasn-1 RNAi y 46,1 ± 3,4 para la etapa de concordancia RNAi control, P ≤ 0,05). Así, en este ejemplo se puede confirmar por análisis bioquímico que fasn-1 tiene un papel en el almacenamiento de lípidos en lugar de sólo una reducción de la etapa específica de la masa grasa. El análisis de seguimiento de los gusanos con imagen depende en gran medida de una plataforma computacional como Profiler célula utilizandola WormToolbox 30. Para los pequeños números de imágenes, una plataforma de análisis de imagen disponible públicamente, tal como ImageJ, disponible gratuitamente en el NIH, puede ser utilizado. Para nuestro análisis, únicas secuencias de comandos de Matlab se utilizó por primera vez para identificar el bien, y posteriormente para excluir a los pozos vacíos o con burbujas, y distinguir pequeños desechos de gusanos. Manual de control de calidad era necesario que las imágenes marcadas por la exclusión por las razones mencionadas anteriormente. Hemos encontrado empíricamente que la intensidad de píxeles 90a percentil gusano a través de un pozo, normalizada a la zona de gusano a través de un pozo, provistos de acuerdo métrica de intensidad de la tinción en todas las etapas de desarrollo gusano (Figura 3). La integración de la masa grasa total sobre la zona del tornillo sinfín, por el contrario, tendería a marcar pequeños gusanos brillantes equivalentemente con grandes gusanos oscuros. Debido a que nuestro método no se integra la señal fluorescente total sobre la zona del tornillo sinfín, en la toma de un percentil intensidad, cambios en el tamaño gusano per se no hacert sesgo de la intensidad medida. En su lugar, las diferencias en la distribución de intensidad de los píxeles se miden. Sin embargo, a pesar de esto, pronunciadas diferencias se ven en la tinción de distribución de intensidad de los píxeles entre animales de diferentes etapas de desarrollo, por lo que es importante para estudiar el efecto de RNAi para cualquier gen contra los animales de una fase comparable de desarrollo (Figura 3). Variabilidad media entre las réplicas se muestra en la Figura 4 que indica alta reproducibilidad del método de tinción de la grasa. Tenga en cuenta que la fuerza del método es altamente dependiente de la obtención de imágenes de calidad para cada placa, bajo condiciones de iluminación uniforme, usando tiempos de exposición idénticos, y con un mínimo de burbujas, escombros, o cruzado de gusanos en otros pozos. SPE se realizó en pre-mezclado, purificado estándares para determinar el grado en el cual las etiquetas podrían ser separados de PLS (Figura 5A). En este análisis, se logró un 100% separation de TAG y PL, indicado como una ausencia total de 17:00 ácidos grasos derivados de PL en la muestra TAG y una ausencia completa correspondiente de 13:00 ácidos grasos derivados de etiqueta en la muestra PL (Figura 5A). Así SPE es muy eficiente en la separación de clases de lípidos. Este análisis no indica que todas las etiquetas de diferentes longitudes de cadena se purificó de manera equivalente por SPE y detectado por GCMS con eficiencia similar. Sólo se asegura que TAG y lípidos PL en total están completamente separados unos de otros. Una muestra de GC-MS rastro de N2 animales de tipo salvaje tomadas a través de extracción en fase sólida y la preparación de FAME se muestra en la Figura 5B. Por tanto TAG y PL, los picos pueden ser identificados en base al tiempo de retención y iones primarios e hija en el espectro de masas, y la superficie total de los picos identificados normalizado a la zona de los estándares internos respectivos. Para determinar la cantidad normalizada de TAG, el áreabajo todos los picos del cromatograma TAG, excepto el estándar 13:00, se suman y se dividen por el área bajo el pico de 13:00. Del mismo modo, para determinar la cantidad normalizada PL total, el área bajo todos los picos, con excepción de la norma 17:00, se suman y se dividen por el área bajo el pico de 17:00. Los valores normalizados de la TAG y las muestras de PL se utiliza entonces para calcular la final TAG / PL relación para la muestra: <img src="/files/ftp_upload/50180/50180eq1.jpg" alt="Ecuación 1" fo:content-width="2.6in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180eq1highres.jpg"/> Cabe señalar que los datos de SPE-GCMS permiten un análisis mucho más sofisticado de los ácidos grasos presentes en cada fracción de lípidos de cálculo simple de la TAG total para la proporción PL. Por ejemplo, el investigador puede integrar un único pico correspondiente a un solo ácido graso y comparar su abundancia normalizado a través de muestras (por ejemplo, COMPARACIÓN en N2 de tipo salvaje versus daf-2 RNAi el área integrada del pico 18:00 dividido por el pico 13:00 estándar, normalizado a la masa total dividido por PL PL área de pico de patrón 17:00): <img src="/files/ftp_upload/50180/50180eq2.jpg" alt="Ecuación 1" fo:content-width="4.873in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180eq2highres.jpg"/> Si el investigador elegir, también sería posible determinar el porcentaje de cualquier ácido graso dado en el TAG o fracciones PL como un porcentaje de la cantidad total de ácido graso cuantificó (como un ejemplo 18:00 en la fracción TAG en gusanos N2 ): <img src="/files/ftp_upload/50180/50180eq3.jpg" alt="Ecuación 1" fo:content-width="4.123in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180eq3highres.jpg"/><img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig1.jpg"alt = &quot;Figura 1&quot; fo: content-width = &quot;3.25in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50180/50180fig1highres.jpg&quot; /&gt; Figura 1. Flujo de trabajo típico para el experimento global. Día 1, congelados RNAi placas de la biblioteca están estampados sobre Amp / Tet placas de agar LB y se incubó a 37 ° C. Día 2, Amp / Tet placas se utilizan para cultivos de siembra líquidas de clones RNAi en bloques profundos pozos. Día 3, las bacterias se concentraron por centrifugación y se transfirieron a placas de 96 pocillos de RNAi. Día 4, L1 cría C. elegans se añadieron a placas de RNAi en líquido y se deja secar. Día 7, los animales se recogen en el líquido, se tiñeron con Rojo Nilo en 40% de isopropanol, montado en portaobjetos de 96 pocillos de teflón, y con imágenes de un microscopio de alto rendimiento. <img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180fig2highres.jpg"/> Figura 2. Fijador basados ​​Rojo Nilo manchas importantes <em&gt; C. elegans reservas de grasa. Representante de campo brillante y las imágenes de fluorescencia de GFP se muestran de N2 gusanos se alimentan de fasn-1 (grasa pequeña, baja), lpd 3 (bajo en grasa), control (vector vacío), o daf-2 (grasas) RNAi clones. Las muestras se procesaron según el protocolo (esquema de la Figura 1). Animales fijadas en paraformaldehido en rojo Nilo, y el resultado imagen formada en los niveles de lípidos comparables como se obtiene de la medición de lípidos bioquímica. Isopropanol-fijos Rojo Nilo, los niveles de fluorescencia adquiridos de al menos biológico 6 repeticiones, se muestran en la primera fila. Los niveles cuantitativos de triglicéridos y reflexivos del total de reservas de lípidos neutros cuando se normalizan los niveles de fosfolípidos totales (TAG / PL), extraídos de 4 repeticiones biológica, se muestran en la segunda fila. Es importante señalar que la cuantificación absoluta de lograr fijador tinción con rojo Nilo y la determinación bioquímica de lípidos a menudo no coinciden perfectamente. En este caso, aunque cualitativamentesimilar, fasn-1 (RNAi) tiene una masa de triglicéridos más diferente frente a control por métodos bioquímicos que la indicada por microscopía, lpd-3 es comparativamente diferente, y daf-2 (RNAi) es menos diferente, aunque todas las diferencias son estadísticamente muy significativa y mediciones fueron altamente reproducible. Los datos mostrados son la media ± SEM (*, P ≤ 0,01; **, P ≤ 0,0001 en relación con el control, determinada por unpaired, dos colas t-test asumiendo igualdad de varianza). <img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. La masa grasa determinada por tinción con rojo Nilo fijación en diferentes estadios larvarios. Animales Se hicieron crecer las bacterias en OP50 y recogida en la L1, L2, L3, L4 y grávidas de desarrollo etapas adultas. Las imágenes fueron capturadas después de la tinción de fijación y se analizaron usando un script de Matlab personalizado para determinar el 90 º percentil of pixel intensidad sobre el área de gusano identificado. Nótese que los niveles de lípidos de los animales aumentan en gran medida como el animal se desarrolla a partir de L2 a L4 etapa, y luego disminuyen ligeramente a medida que el animal comienza a desviar calorías hacia la proliferación de la línea germinal en la etapa adulta. Los datos mostrados son la media ± SEM de repeticiones 6-8 (**, P ≤ 0,0001 en relación a la edad adulta grávida, determinado por unpaired, dos colas t-test). <img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. La alta reproducibilidad entre repeticiones biológica independiente. Se muestra un gráfico de dispersión de la intensidad de fluorescencia roja del Nilo a través biológicos repeticiones (n = 6-8). Para cada repetición, todos los valores se normalizaron a la media de intensidad de los controles de vectores vacíos. Los datos mostrados son la media ± SEM (**, P ≤ 0,0001 en relación con el control, determinada por unpaired, dos colas t-test suponiendoigualdad de varianza). <img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig5.jpg" alt="Figura 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180fig5highres.jpg"/> Figura 5. GC-MS cromatogramas de SPE separados normas y etiqueta de tipo salvaje y abundancia PL. (A) GC-MS se muestran rastros de la EPE separación de TAG y los estándares PL. Nótese la ausencia completa de ácido graso 13:00 en la traza de PL y la correspondiente ausencia de la ácido graso 17:00 en la traza TAG, lo que indica una separación completa de TAG (tritridecanoin) a partir de PL (1,2-diheptadecanoyl-sn-glicero -3-fosfo-(1&#39;-rac-glicerol)). (B) Un representante espectro completo de TAG y PL partir de una muestra de N2 de tipo salvaje animales alimentados con el control de vectores RNAi (HT115 bacterias con L4440 vacío vector RNAi). Un microlitro de muestra se inyecta en un GCMS Agilent 6890/5973N de acuerdo con el protocolo, y los diferentes picos se identificaron mediante la retention tiempo y sus espectros de masas correspondiente. Abreviaturas: ciclo, ciclopropano ácido graso; ISO: iso-. Metílico de ácido graso de cadena ramificada, GLA, ácido gamma linolénico, ALA, el ácido alfa linolénico; DGLA, ácido linolénico gamma dihomo, EPA, ácido eicosapentaenoico <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50180/50180fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> .

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Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Se presentan sólidos métodos bioquímicos y microscópicos para el estudio de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Tiendas de lípidos. Una rápida, sencilla, que se fijan-Procedimiento de tinción para imágenes fluorescentes gotas de lípidos aprovecha las propiedades espectrales del colorante rojo Nilo lipófilo. A continuación se presentan medición bioquímica de triglicéridos y fosfolípidos utilizando extracción en fase sólida y cromatografía de gases-espectrometría de masa.

Bioquímica y de Evaluación de Rendimiento microscópica de masa grasa en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

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Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Extracción y análisis de prostaglandina en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Selección de alto rendimiento para moduladores químicos de genes post-transcripcionalmente regulados

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

El cultivo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; En tres dimensiones en el Laboratorio

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Nucleótido y extracciones de proteínas de Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Medición de las tasas de consumo de oxígeno en intacto Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...